用于检测 lentil 炭疽病菌（Colletotrichum lentis）中导致第11类杀菌剂不敏感性的 G143A 点突变的分子检测方法的开发

《Journal of Plant Pathology》：Development of molecular assays to detect the G143A point mutation responsible for group 11 fungicide insensitivity in Colletotrichum lentis

　　

由 Colletotrichum lentis 引起的炭疽病（anthracnose）是加拿大 lentil 最重要的叶部病害。该病害的管理 heavily 依赖于 strobilurin 类杀菌剂有效成分。然而，近期在加拿大萨斯喀彻温省商业 lentil 田中已报道 C. lentis 对 strobilurin 产生不敏感性。本研究描述了两种聚合酶链式反应（PCR）检测方法，用于检测 C. lentis 细胞色素b（cytochrome b）基因中的 G143A 突变，该突变导致 strobilurin 不敏感性。在第一种检测方法中，使用了敏感型（sensitive, S）和不敏感型（insensitive, I）特异性订制正向引物，其3′-末端分别含有双脱氧胞苷（ddC）或双脱氧鸟苷（ddG），并配合通用反向引物。当使用无校正活性的 Taq DNA 聚合酶时，两种引物组合均不能扩增靶标，因为3′-末端的 ddC 或 ddG 阻断了引物延伸。当加入少量具有3′-5′校正活性的高保真 DNA 聚合酶后，ddC 和 ddG 引物分别能够扩增携带赋予 strobilurin 敏感性或不敏感性等位基因的 C. lentis DNA 模板。第二种检测方法利用引物倒数第二个核苷酸的错配，所得结果与 dd 检测法一致。对8个 C. lentis 菌株的部分细胞色素b基因进行测序，以及对 C. lentis 菌株进行体外杀菌剂不敏感性测定，均证实了上述分子检测方法的可靠性。由于这些方法基于常规 PCR，因此有望被方便地改造用于区分具有点突变的不同等位基因。

由 Colletotrichum lentis 引起的炭疽病（anthracnose）是加拿大 lentil 最重要的叶部病害，可导致超过70%的产量损失。目前该病管理 heavily 依赖含 Fungicide Resistance Action Committee（FRAC）第11类即 strobilurin [喹啉外抑制剂（quinone outside inhibitor, QoI）] 有效成分的杀菌剂。strobilurin 类杀菌剂特异性结合细胞色素b的喹啉氧化（quinol oxidation, Qo）位点，阻断细胞色素b与细胞色素钰c1之间的电子传递，从而抑制线粒体呼吸。然而，由于其位点 pumpkin 的作用模式以及单个点突变即可导致高水平不敏感性，QoI 类杀菌剂存在较高的不敏感性产生风险。自1996年 QoI 杀菌剂引入以来，多种植物病原真菌已对该类杀菌剂产生不同程度的不敏感性。近期在萨斯喀彻温省商业 lentil 田中已报道 C. lentis 对第11类杀菌剂的不敏感性。真菌对某一种 QoI 有效成分产生不敏感性后，很可能对其他 QoI 类杀菌剂也不敏感，因其具有相似的作用模式。植物病原真菌（包括 C. lentis）中 QoI 不敏感性最常见的机制是细胞色素b基因中的点突变[开放阅读框（open reading frame, ORF）第428位的鸟嘌呤（G）变为胞嘧啶（C）]，该突变导致第143位的甘氨酸变为丙氨酸（G143A）。G143A 突ml 通常使不同植物病原真菌对 QoI 类杀菌剂产生高水平不敏感性。

鉴于 QoI 类杀菌剂对控制 lentil 炭疽病的重要性及该类杀菌剂不敏感性产生的高风险，对 C. lentis 不敏感性进行有效监测至关重要。体外孢子萌发或病原菌生长抑制试验是检测杀菌剂不敏感性的经典方法，但这些方法劳动强度大、耗时，不适用于大量田间样品的检测。因此，开发快速、特异、可重复的分子检测方法对于田间样品的筛查具有重要意义。

研究人员针对上述问题开展了本项研究，旨在开发能够快速区分 C. lentis 敏感型（S）和不敏感型（I）菌株的 PCR 检测方法。研究最终建立了两种基于常规 PCR 的等位基因特异性检测方法，并通过对部分 C. lentis 菌株的细胞色素b基因进行 Sanger 测序验证，以及对菌株进行体外杀菌剂敏感性测定加以验证。该研究的意义在于提供了一种快速、简便、经济的分子检测手段，可在任何具备基本 PCR 条件的实验室开展，为田间监测 C. lentis 对 strobilurin 类杀菌剂的不敏感性提供了有效工具。该论文发表在《Journal of Plant Pathology》。

研究人员为开展此项研究主要采用了以下关键技术方法：从萨斯喀彻温省商业 lentil 田具有炭疽病症状的植物样本中分离 C. lentis 菌株；利用 DNeasy Plant Mini Kit 从植物组织或纯培养物中提取 DNA；基于 C. lentis 细胞色素b基因序列设计等位基因特异性引物，包括双脱氧（dideoxy, dd）末端修饰引物和倒数第二位核苷酸错配引物；通过梯度 PCR 优化引物退火温度和高保真 DNA 聚合酶用量；采用多重基因座系统发育分析对分离菌株进行鉴定；利用 Sanger 测序验证 PCR 检测结果；通过含不同浓度 trifloxystrobin（有或无水杨基异羟肟酸，salicylhydroxamic acid, SHAM）的 PDA 培养基进行体外菌丝生长速率测定和孢子萌发试验，评估菌株的杀菌剂敏感性；使用 SAS 统计软件进行数据分析。

研究结果部分：

**C. lentis 细胞色素b基因的扩增**

研究人员首先评估了设计的正向和反向引物（Cl-For 和 Cl-Rev）从16个具有炭疽病症状的 lentil 植物样本中扩增 C. lentis 细胞色素b基因片段的能力，获得了预期大小的产物。考虑到 lentil 炭疽病症状与由 Ascochyta lentis 引起的 ascochyta 疫病及由 Stemphylium botryosum 引起的 stemphylium 疫病相似，研究人员还测试了这些引物对 S. botryosum 和 A. lentis 的检测特异性，结果发现这些引物不能扩增 S. botryosum DNA，且仅能从 A. lentis DNA 产生极弱的条带。

**dd 引物的有效性**

双脱氧引物的阻断效率是影响等位基因检测特异性的关键因素。研究人员首先仅用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR，使用不敏感型（CTC）和敏感型（CT-21）对照 C. lentis 菌株及6个植物样本的 DNA 作为模板。结果显示，无论模板类型如何，ddC 和 ddG 引物组合均不产生任何信号，表明将未修饰的 C 或 G 替换为 ddC 或 ddG 可有效阻断模板扩增。随后，研究人员在反应中加入0.2 U 高保真（high-fidelity, HF）DNA 聚合酶重复 PCR。HF DNA 聚合酶的3′-5′核酸外切酶活性可校正模板与引物末端之间的错配，切除错配核苷酸。当模板为敏感型时，细胞色素b ORF 第428位为 G，ddG 引物与靶序列完美匹配，因缺乏3′-OH 而不被延伸，无 PCR product；当模板为不敏感型时，第428位为 C，ddG 与模板不匹配，HF 聚合酶的 proof-reading 活性将 ddG 替换为 C，引物得以延伸。同理，ddC 引物不延伸于不敏感型模板，而在敏感型模板中产生 PCR product。实验结果显示，ddC 引物在敏感型 C. lentis 菌株（CT-21）中产生信号，ddG 引物在不敏感型菌株中产生信号，而在敏感型菌株中无信号。

为确定 HF DNA 聚合酶的最佳浓度，研究人员使用0.15、0.20和0.25 U 进行 PCR。结果显示，0.15 U 时部分植物样本信号较0.20 U 弱，而0.25 U 则可能因校正过度导致非特异性扩增。因此后续实验采用0.20 U。研究人员还优化了引物退火温度，在50.5、52、53和54.5 ℃下进行梯度 PCR。结果显示，52 ℃及以上温度时模板扩增效果较好，但52 ℃时植物样本 P1 仅能用 ddC 引物产生弱信号。为最大化植物样本模板的扩增潜力，选择52 ℃作为后续实验的退火温度。

**方法的特异性和敏感性**

研究人员使用0.05至20 ng 不同浓度的 CT-21（S 对照）和 CTC（I 对照）DNA 评估方法特异性。结果显示，ddC 引物在低于1 ng CTC 模板时产生弱信号，而 ddG 引物在 CT-21 模板中未产生可见信号，表明 ddG 引物延伸被完全阻断。敏感性评估显示，ddC + Cl-Rev 引物对可清晰扩增0.1至10 ng 模板 DNA，ddG + Cl-Rev 引物对可扩增0.05至4 ng 模板 DNA；更高浓度时信号强度下降。研究人员将 C. lentis DNA 与 healthy lentil 幼苗 DNA 混合模拟田间样本，发现非模板 DNA 的存在可改善方法特异性，但会降低敏感性。研究人员分析了16个症状性田间植物样本，结果显示多种情况：仅检测到 strobilurin 不敏感型、仅敏感型，或两种类型均存在。10个样本中未检测到 strobilurin 敏感型 C. lentis，表明 ddC 引物不能扩增不敏感型 C. lentis DNA，可有效区分两种类型。

**非双脱氧（错配）引物的等位基因特异性扩增及序列比较**

研究人员测试了新的非双脱氧正向引物与 Cl-Rev 的组合。结果显示，Gly2F + Cl complete 引物对仅对敏感型菌株特异，Ala3F + Cl-Rev 引物对仅对不敏感型菌株特异。将 Gly2F + Cl-Rev 和 Ala3F + Cl-Rev 引物对用于8个 C. lentis 菌株（2个对照和6个田间分离株），结果与 dd 引物法一致。通过对4个敏感型和4个不敏感型菌株的部分细胞色素b基因进行 Sanger 测序验证，发现所有敏感型菌株第428位核苷酸为 G（密码子 GGT），所有不敏感型菌株为 C（密码子 GCT），与 PCR 检测结果完全一致。

**体外杀菌剂耐受性测定**

实验一显示，CT-21 的菌丝径向生长在所有 trifloxystrobin 浓度下均显著降低，而 CTC 即使在10 mg L^-1 下也无显著抑制，EC₅₀ 为1.5 mg L^-1；0.5 mg L^-1 可作为区分 I 和 S 菌株的鉴别剂量。实验二（无 SHAM）中，CT-21 和 Cl 2020-001 在所有浓度下生长均受抑制，而 CTC 不受抑制；Cl 2020-003 和 Cl 2020-016 仅在5.0 mg L^-1 时生长受抑。实验三（有 SHAM）中，trifloxystrobin 对 CT-21、Cl 2020-001 和 Cl 2020-003 的生长有显著影响，但对 CTC 和 Cl 2020-016 无显著影响。孢子萌发试验结果与菌丝生长试验一致：CT-21、Cl 2020-001 和 Cl 2020-032 的孢子萌发在所有杀菌剂浓度下均降低，而 Cl 2020-015 和 CTC 不受影响或影响不显著。

讨论部分总结：研究人员开发的两种 PCR 检测方法基于常规 PCR 平台，第一种方法利用3′-双脱氧核苷酸修饰的等位基因特异性引物，第二种方法利用倒数第二位核苷酸错配的引物，两种方法均能有效区分 C. lentis 对 strobilurin 的敏感型和不敏感型等位基因。方法的重要技术关键在于 dd 引物3′-末端的双脱氧修饰阻断了引物延伸，而高保真 DNA 聚合酶的 proof-reading 活性可在引物与模板错配时切除 ddNTP，使引物得以延伸，从而实现等位基因特异性扩增。研究人员通过系统优化高保真酶用量和退火温度，平衡了检测的特异性和敏感性。研究发现植物来源的非模板 DNA 虽可降低检测敏感性，但同时也能减少非特异性扩增，这对田间样本检测具有实际意义。体外杀菌剂试验结果与分子检测结果高度一致，验证了检测方法的可靠性。值得注意的是，部分田间分离株（如 Cl 2020-001）在无 SHAM 时表现出较对照菌株更高的 EC₅₀，提示可能存在一定程度的替代呼吸途径，但加入 SHAM 后其 EC₅₀ 与敏感型对照相近。

研究结论部分翻译：目前有多种方法可用于鉴定基因点突变。下一代测序（next-generation sequencing, NGS）和微滴式数字 PCR（droplet digital-PCR, ddPCR）能够检测低水平突变，但需要专门的仪器设备、时间和资源。限制性酶切后测序是另一种检测点突变的方法。然而，与需要 NGS 和 ddPCR 的技术相比，基于常规 PCR 的突变鉴定方法快速且经济。研究人员开发的 PCR 方法在一个检测中使用 ddNTP 阻断引物，在另一个检测中使用错配引物，同时使用常规 PCR 试剂。3′-dd 阻断或错配引物可商业合成。此处呈现的方法不需要某些方法（如 Kompetitive Allele Specific PCR, KASP 和竞争性等位基因特异性 TaqMan PCR, CAST-PCR）可能需要的专有试剂。此外，由于这些方法基于常规 PCR 反应，无需重新设计或优化检测试剂，且可在任何具备 PCR 设施的实验室中进行。然而，此处呈现的终点 PCR 方法是定性的而非定量的，不能提供混合样本中 I 和 S 等位基因的相对丰度信息，也不提供基因序列信息。终点 PCR 方法具有被改造应用于其他系统的潜力，在这些系统中研究人员希望区分具有点突变的等位基因，从而使广泛的科学领域受益于其简便性、低成本和特异性。