《Nano Today》：Spectrally orthogonal fluorescent imaging of homocysteine and viscosity in atherosclerosis with therapeutic modulation
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动脉粥样硬化中同型半胱氨酸代谢与细胞粘度异常的关联机制及荧光探针HV的构建与应用
甘雅冰|程振波|江欣|李阳|于婷|金浩宇|张友玉|李海涛|尹鹏
化学生物学与中药研究重点实验室（教育部），湖南师范大学化学与化学工程学院跨学科研究所以及化学与化学工程系，中国长沙410081
摘要
光谱正交的荧光染料能够同时可视化活体系统中的多种分子事件，为解析疾病机制提供了强大的工具。动脉粥样硬化（AS）是一种复杂的炎症性疾病，其中同型半胱氨酸（Hcy）的失调和细胞粘度的改变起着关键但尚未完全理解的作用。然而，同时监测这两个参数仍然具有挑战性。在这里，我们报道了一种光谱正交的双通道荧光探针（
HV）的合理设计，该探针可以实时、选择性地检测Hcy和细胞内粘度。
HV将一个特异性识别Hcy的单元与一个对环境敏感的荧光团结合在一起，生成了不重叠的发射通道，避免了光谱干扰。利用
HV，我们发现了Hcy水平升高与泡沫细胞形成过程中微粘度重塑之间的先前未被认识到的关系。在活细胞和ApoE
-/
-小鼠模型中的成像研究进一步表明，叶酸和维生素B
12的补充可以通过纠正与Hcy相关的粘度异常来缓解AS的进展。总体而言，这项工作建立了Hcy代谢、粘度失调与动脉粥样硬化进展之间的直接联系，并突显了
HV作为机制研究和治疗评估的多功能工具的重要性。
引言
动脉粥样硬化（AS）是一种具有高度复杂发病机制的进行性炎症性疾病，它是心肌梗死、缺血性心肌病和中风等主要心血管和脑血管事件的根本原因，是全球发病率和死亡率的主要原因[1]、[2]、[3]、[4]。在各种风险因素中，流行病学和机制研究已将同型半胱氨酸（Hcy）确定为AS的一个独立且关键的致病因素[5]、[6]。升高的Hcy会损害内皮细胞，并参与斑块形成、进展和破裂的多个阶段[7]、[8]、[9]。同时，氧化应激也被认为是动脉粥样硬化病变的核心驱动因素[10]、[11]。在氧化应激下，细胞内微环境会发生深刻的变化，包括粘度异常，这会改变代谢物的扩散、干扰信号传导并加剧细胞功能障碍[12]、[13]。尽管粘度失调的重要性显而易见，但其在AS中的作用仍不甚明了，而且Hcy是否直接影响动脉粥样硬化相关细胞（如泡沫细胞）的粘度也尚未得到充分探索。解决这一难题需要能够实时同时监测Hcy和粘度动态的工具。
荧光探针由于其高灵敏度、操作简便性和非侵入性特性，已成为生物医学研究中的强大工具[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。已有几种探针被用于与AS相关的研究，主要集中在脂滴或活性氧物种上（表S2）[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。然而，由于Hcy在结构和化学上与半胱氨酸相似，只有少数荧光探针被专门设计用于选择性检测Hcy，其在AS中的应用仍然很少[36]、[37]、[38]。此外，针对单一分析物的探针往往无法捕捉AS的多因素性质。相比之下，能够同时且正交地检测多种分析物的双通道探针可以提供更全面的机制洞察并提高诊断准确性[39]。然而，许多传统的双通道系统存在光谱重叠或信号干扰的问题，这影响了复杂生物环境中的定量可靠性。在这方面，光谱正交的荧光探针具有明显优势：通过使用完全分离的发射通道来避免干扰，它们能够精确、高保真地同时追踪活体系统中的多个目标，从而克服了传统双通道探针的关键限制。
在这里，我们报道了一种光谱正交荧光探针（
HV）的设计和合成，该探针可以实现活体系统中Hcy和粘度的实时双通道成像。探针
HV通过哌嗪连接剂将一个选择性的Hcy响应模块与一个对环境敏感的单元共价结合，实现了两个完全分离的发射通道，没有光谱干扰。这种设计允许高度选择性地同时监测与动脉粥样硬化相关的细胞的生物化学和生物物理变化。利用
HV，我们发现了由氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）诱导的泡沫细胞形成过程中Hcy积累与粘度失调之间的直接关系。此外，在动脉粥样硬化小鼠模型中的应用表明，通过叶酸和维生素B
12的补充可以降低Hcy水平，从而缓解粘度异常并减缓疾病进展。这些发现不仅建立了Hcy、粘度和AS发病机制之间的联系，还将
HV定位为一个用于早期诊断、机制探索和动脉粥样硬化治疗监测的强大平台。
探针HV的设计
Hcy在整个动脉粥样硬化的发生过程中起着关键作用，而细胞粘度的改变也被认为会促进疾病进展（图1a）。因此，开发一种能够同时区分和检测Hcy和粘度的双通道探针对于监测它们在动脉粥样硬化过程中的动态变化非常有益，从而有助于早期诊断、治疗评估和更深入地理解疾病机制。
结论
总之，我们合理设计并合成了一种光谱正交的双通道荧光探针
HV，能够同时且选择性地高灵敏度地检测Hcy和粘度。独立的绿色（Hcy）和红色（粘度）通道实现了活细胞中生物化学和生物物理变化的同步动态成像。利用
HV，我们证明了升高的Hcy直接调节细胞内粘度，揭示了一个之前未被探索的机制。
CRediT作者贡献声明
李阳：验证。
江欣：正式分析、数据管理。
程振波：资金获取、正式分析、概念构思。
甘雅冰：撰写——初稿、实验研究。
尹鹏：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。
李海涛：资金获取、概念构思。
张友玉：概念构思。
金浩宇：正式分析。
于婷：撰写——审稿与编辑、监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了
国家自然科学基金（项目编号：22277026、82301882、22376057）和
湖南省自然科学基金（项目编号：2025JJ50583）的支持。
