双模态SonoVue微泡结合靶向荧光与对比增强超声技术，用于早期肿瘤诊断

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Dual-Modality SonoVue Microbubbles Integrating Targeting-Fluorescence and Contrast-Enhanced Ultrasound for Early Tumor Diagnosis

肿瘤靶向双模态超声造影剂SonoVue-DBCO-Cy5通过SPAAC反应实现分子特异性靶向，结合超声空化效应增强肿瘤微血管渗透性和探针蓄积，使肿瘤显影提前36小时，保留率提升2.6倍。

　　

Bing Ying|Xiaojin Wu|Chenke Pan|Miaomiao Li|Xinyue Zhu|Jianhua Fang|Kai Zhang|Jian Chen

浙江大学医学院第四附属医院超声医学系，义乌322000，中国

摘要

早期和准确的肿瘤检测仍然是肿瘤学中的一个主要挑战。在这里，我们开发了一种肿瘤靶向的双模态成像探针SonoVue-DBCO-Cy5（SDC），方法是将DBCO修饰的Cy5荧光团嵌入到临床批准的SonoVue?微泡的脂质壳中。在用Ac?ManNAz代谢标记的肿瘤细胞中，含有叠氮基的糖链允许通过无铜的应变促进叠氮-炔环加成（SPAAC）反应实现特异性SDC识别。SPAAC靶向作用与超声诱导的微泡空化和声孔效应的结合，通过增加血管通透性和促进探针在肿瘤组织中的积累，大大增强了荧光标记和对比增强超声（CEUS）信号。结果，SDC的肿瘤滞留能力提高了2.6倍，并且比单独使用传统CEUS早约36小时实现肿瘤可视化。这些特点使得SDC成为一个可临床转化的、生物正交的双模态成像平台，它结合了分子靶向和空化协同作用，用于实时、无放射性的早期肿瘤诊断和图像引导治疗。

引言

全球癌症发病率持续上升，预计从2022年的约2000万例增加到2050年的近3500万例——增幅超过75%[1]。这一日益严重的负担凸显了需要早期和精确的诊断策略，以便在肿瘤初期阶段识别恶性病变，从而改善预后并降低治疗成本。传统的成像方法如计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）可以提供高分辨率的解剖信息，但受到检查时间长、成本高以及CT辐射暴露的局限[2]、[3]、[4]。相比之下，超声成像提供了一种实时、无辐射且成本效益高的替代方案，广泛应用于肿瘤筛查、术中导航和术后监测。

对比增强超声（CEUS）通过引入充满气体的微泡来进一步提高病变的可检测性，这些微泡增强了血流对比度并实时显示微血管结构。CEUS在诊断实体瘤方面表现出高灵敏度和特异性，尤其是在肝脏、甲状腺和乳腺[5]、[6]。在临床可用的试剂中，SonoVue?（充满SF?的磷脂壳微泡）具有优异的体内稳定性、良好的安全性以及快速的肺部清除率（平均直径约2.5 μm，90%小于6 μm）[7]、[8]。自获得FDA批准用于心脏和肝脏成像[9]以来，SonoVue?已广泛应用于肿瘤学和淋巴成像[10]、[11]、[12]。

然而，传统的CEUS试剂仅作为被动血液池示踪剂，缺乏主动肿瘤识别能力[13]。这一缺陷限制了它们检测小病灶或早期病变的灵敏度，并阻碍了恶性组织和正常组织之间的区分。为了克服这一限制，赋予主动靶向能力的策略受到了越来越多的关注。生物正交化学，特别是应变促进的叠氮-炔环加成（SPAAC）反应，能够在生理条件下实现快速、选择性和无铜的 conjugation[14]、[15]、[16]。当与代谢糖工程结合时，例如在肿瘤细胞糖链上引入叠氮基的Ac?ManNAz，可以通过环辛炔修饰的探针（如二苯并环辛炔（DBCO）功能化的染料或纳米颗粒）实现特异性肿瘤细胞靶向，确保高生物相容性和最小的脱靶效应[17]、[18]。

在本研究中，我们首次通过将DBCO修饰的Cy5荧光团嵌入SonoVue?微泡的脂质壳中，开发了一种肿瘤靶向的双模态超声造影剂SonoVue-DBCO-Cy5（SDC）。本研究的目标是：（1）合成并表征SDC的物理化学性质，确保其保持SonoVue?的固有声学特性；（2）研究SDC通过SPAAC反应对用Ac?ManNAz代谢标记的肿瘤细胞的生物正交靶向效果；（3）评估超声诱导的微泡空化和声孔效应在增强荧光标记和CEUS信号方面的协同作用。我们调查了以下假设：（1）DBCO-Cy5的物理嵌入不会影响SonoVue?微泡的回声性或稳定性；（2）SPAAC介导的靶向能够使探针在肿瘤组织中特异性积累；（3）与单独使用传统CEUS相比，双模态平台能够显著提前实现肿瘤可视化。

部分内容片段

SDC的制备

根据官方说明，将冻干粉末与5毫升无菌盐水重新配制后剧烈摇晃，制备SonoVue?微泡。对于SDC的制备，将DBCO-Cy5（Bide Pharmatech Ltd., 上海，中国）溶解在5毫升盐水中，制成不同浓度的溶液，用于重新配制冻干SonoVue?粉末。悬浮液剧烈摇晃后，在暗处用振荡器轻轻混合30分钟，以便表面加载。

SDC的制备与表征

进行了全面的物理化学分析，以比较SonoVue?和SDC微泡的性质。如图2A和图S1所示，两种样品均呈现均匀的球形形态。与未改性的SonoVue?光滑的表面相比，SDC的壳上显示出分散的电子密集区域，这表明DBCO-Cy5荧光团已成功嵌入磷脂膜中。

结论

在这项工作中，我们通过将DBCO-Cy5荧光团嵌入SonoVue?微泡的脂质壳中，开发了一种双模态肿瘤靶向造影剂（SDC）。该改性配方保留了SonoVue?的天然声学稳定性和回声性，同时引入了荧光功能和生物正交的肿瘤选择性。重要的是，超声诱导的微泡空化与生物正交靶向作用产生了协同效应。

利益冲突

作者声明他们没有可能影响本研究报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

作者贡献声明

Bing Ying：撰写 – 原稿，资源，方法学。 Jian Chen：监督，项目管理。 Jianhua Fang：监督。 Kai Zhang：撰写 – 审稿与编辑。 Miaomiao Li：形式分析。 Xinyue Zhu：验证。 Xiaojin Wu：验证，软件。 Chenke Pan：研究。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

K.Z.感谢浙江省自然科学基金（编号LY23B040004）的财政支持；J.C.感谢浙江省横向科技项目（编号2021-KYY-518053-0036）、浙江省自然科学基金联合基金（编号LKLZ25H180001）以及由工业和信息化部资助的国家医疗设备推广计划（编号2024TGYY11）的财政支持。