《International Journal of Biological Macromolecules》：Constructing cellulosomes to enhance lignocellulose degradation and biotechnological applications: A review
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可持续能源需求推动细胞壁综合体研究，分析其结构多样性、协同机制及工业应用。通过合成生物学工程优化，如改造 scaffoldin、宿主微生物优化及酶整合，显著提升木质纤维素降解效率与稳定性。提出双dockerin模块、三重互作及糖基化增强稳定性的设计新原理，拓展其在生物燃料及工业制造中的应用前景。
Zeba Khatoon|Marimuthu Anandharaj|Jui-Jen Chang|Wen-Hsiung Li
中国科学院生物多样性研究中心，台北，11529，台湾
摘要
对可持续和可再生能源需求的增加推动了高效木质纤维素生物加工策略的研究。纤维素体是厌氧微生物中进化出的复杂多酶复合体，能够有效降解木质纤维素生物质。本文综述了天然和工程化纤维素体的最新进展，强调了它们的结构多样性、协同机制及其工业应用价值。通过对来自Clostridium、Ruminococcus和Bacteroides属的天然纤维素体的比较分析，揭示了它们在支架蛋白结构、cohesin-dockerin特异性以及底物识别方面的进化特征。基于这些天然框架，“设计型纤维素体”作为模块化平台出现，旨在增强催化协同作用和热稳定性，最终实现整合生物加工（CBP）。合成支架蛋白设计、微生物宿主优化（例如Saccharomyces cerevisiae、Bacillus subtilis和Kluyveromyces marxianus）以及操纵子工程的进步，使得酶在纤维素体复合体中的整合更加精确，从而提高了生物质降解效率。将半纤维素酶、木质素酶和氧化酶纳入纤维素体复合体进一步增强了糖化效率并克服了生物质的抗性。诸如双dockerin模块、三部分dockerin相互作用和糖基化增强稳定性等新兴概念重新定义了纤维素体的功能，并为合成生物学提供了新的设计原则。此外，人类肠道相关纤维素体的发现表明其具有更广泛的生态和治疗应用前景。本文强调设计型纤维素体作为下一代生物催化剂在可持续生物燃料和生化生产中的潜力。
引言
木质纤维素生物质是一种可再生且丰富的资源，全球每年产生的量估计为2000亿吨[1]。通过生物转化将生物质可持续地用于生产燃料和增值化学品已成为化石燃料的有吸引力的替代方案[2]、[3]、[4]。然而，木质纤维素的固有抗性仍是主要挑战。纤维素和半纤维素紧密有序的结构，嵌入在木质素基质中，使得碳水化合物部分难以被访问和水解[5]。结晶纤维素由大约7000–15,000个通过β-(1–4)糖苷键连接的葡萄糖单元组成，由于受到交联半纤维素和木质素的屏蔽，使其对纤维素酶具有抗性[6]。因此，已经采用了多种方法（物理、化学和生物方法）来降低木质纤维素生物质的抗性[7]。其中一些方法成本高昂和/或产生有毒副产物，阻碍了微生物的生长和代谢[8]。另一方面，微生物方法环保、能耗低且能高效分解复杂的植物材料[9]。为了克服能量限制（这些限制了大量自由酶的生产[10]），一些厌氧微生物进化出了称为“纤维素体”的复杂酶复合体。
一般来说，天然纤维素体是高度组织化的多酶复合体，其分子量通常在2到6兆道尔顿（MDa）之间，具体取决于复合体中组装的酶的数量和类型[11]。它们可以被合理构建为设计系统，允许定制酶的组成和组织以优化生物质降解。这些复合体具有三个关键特征（图1）：(i) 含有cohesin模块的支架蛋白，(ii) 携带dockerin模块的酶亚基，这些dockerin模块将cohesin结合到支架蛋白上，以及(iii) 靶向不溶性底物的纤维素结合模块（CBMs）。这些模块化系统实现了酶的邻近性、底物识别和协同催化——这是自由酶系统的关键优势[12]。纤维素体的组装依赖于高亲和力的钙依赖性cohesin–dockerin相互作用[13]、[14]、[15]。根据序列和功能特征，dockerin被分为I型、II型和III型[16]。I型dockerin通常介导酶向支架蛋白的整合，而II型dockerin常将支架蛋白连接到宿主细胞表面的锚定蛋白上，尽管也存在例外[17]、[18]。相比之下，III型dockerin较为少见，主要存在于某些瘤胃细菌中，在Clostridium物种中的结构比I型和II型更为多样[19]。许多I型系统的一个显著特点是双结合模式，dockerin可以以两种不同的方向与cohesin结合[20]、[21]、[22]。这种灵活性增强了酶复合体的结构稳健性和空间适应性。然而，并非所有系统都表现出双结合特性[17]，最近的研究表明结合行为可能是动态调节的，而不仅仅是由对称性决定的[23]、[24]。除了催化酶外，纤维素体还可以包含其他带有dockerin的组分，如蛋白酶和辅助蛋白[25]、[26]、[27]，从而增加了功能多样性。最近发现的双dockerin模块进一步展示了天然纤维素体的结构可塑性和潜在的物种间兼容性[28]、[29]。
本文全面概述了纤维素体研究的最新进展，强调了增强木质纤维素降解和扩展微生物系统在可持续生物加工潜力的工程策略。第一部分探讨了天然纤维素体的结构和功能特性，强调了纤维素酶、半纤维素酶和辅助酶的协同作用。后续部分讨论了合成和基因工程中的新兴方法，这些方法提高了这些复合体的多功能性和效率。
此外，本文还讨论了将纤维素体系统整合到各种微生物宿主（包括细菌和酵母）中的努力，以创建用于木质纤维素转化和整合生物加工（CBP）的强大平台。这些工程化的纤维素体表现出更好的木质纤维素降解能力，从而提高了糖的释放量和产品产量。最后一部分概述了该领域的当前挑战和未来前景，强调了需要继续研究以优化纤维素体工程，以适应不同的原料和工艺条件。总体而言，本文总结了纤维素体构建及其在木质纤维素降解应用方面的最新进展，为可持续生物燃料生产提供了见解。
自然纤维素体的结构多样性
不同细菌物种的天然纤维素体在结构上存在显著差异（表1）。Clostridium thermocellum是一个典型的系统，其主要支架蛋白包含多个I型cohesin用于酶的招募，一个CBM用于纤维素的靶向，以及II型cohesin-dockerin相互作用用于细胞表面的锚定（图2A）[30]、[31]。相比之下，Bacteroides cellulosolvens的cohesin–dockerin组织方式相反，并且能够组装出异常大的复合体
设计型纤维素体：多酶复合体的合成重建
“设计型纤维素体”的概念最早在1994年提出[58]，基于高亲和力的cohesin-dockerin相互作用[59]、[60]。一种关键策略是使用来自不同物种的正交cohesin–dockerin对，以确保选择性的酶招募并避免交叉反应[61]、[62]、[63]。设计型纤维素体是合成工程化的多酶复合体，其组成可以精确控制
提高热稳定性
设计型纤维素体的工业应用要求其具有热稳定性。早期研究通过使用来自超嗜热细菌Caldicellulosiruptor bescii的酶和热稳定的dockerin构建了一个超热稳定复合体[73]。该复合体在75°C下仍保持完整性和活性，优于天然纤维素体和自由酶。通过模块化酶设计也可以实现热稳定性。最近的研究展示了酶的潜力天然纤维素体生产者在工业应用中的局限性
像C. thermocellum、C. cellulolyticum、C. cellulovorans、C. clariflavum和Ruminococcus这样的天然纤维素分解微生物因其通过多酶纤维素体复合体降解结晶纤维素的能力而备受关注。在自然环境中，这些微生物能够有效控制酶的比例、类型和表达时机，以最大化木质纤维素的分解。然而，它们在工业过程中的直接应用仍受到若干内在限制细胞表面展示和联合体方法
已经开发了几种用于木质纤维素生物质生物加工的策略，包括传统的两步水解和发酵过程、同时糖化和发酵过程，以及更先进的CBP方法[152]、[153]。CBP特别具有经济可行性的潜力[154]。纤维素体自然地将多种纤维素酶组织成多酶复合体，促进了底物的传递和高效转化半纤维素酶
半纤维素不仅增加了生物质的抗性，还对酶促水解具有抑制作用，尤其是对关键纤维素酶如Cel48S[172]、[173]。虽然长期以来纤维素酶一直被用于降解纤维素部分，但半纤维素成分需要额外的酶处理才能进一步释放生物质的潜力[98]、[174]。对八种产生纤维素体的细菌菌株的比较分析显示了显著差异其他生物技术应用
纤维素体已成为设计多种生物催化系统的蓝图。其定义特征——高亲和力的cohesin-dockerin相互作用和底物靶向的CBMs——已被重新用于提高酶的效率、稳定性和特异性。这些特性在环境修复、生物传感和工业生物制造等多个领域得到了应用[184]。一个值得注意的应用涉及工程改造结论与展望
纤维素体是自然界设计出的高效酶系统，用于分解难处理的植物生物质。多年来，科学家们从天然纤维素体中获得了重要见解，这些纤维素体通过cohesin-dockerin相互作用将酶组织在支架蛋白上。受这些天然系统的启发，使用合成支架蛋白在工业微生物宿主（即酵母和细菌）中开发出了设计型纤维素体。通过整合针对纤维素的酶CRediT作者贡献声明
Zeba Khatoon：撰写——原始草稿、可视化、概念构思。Marimuthu Anandharaj：撰写——审稿与编辑。Jui-Jen Chang：撰写——审稿与编辑、监督。Wen-Hsiung Li：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。致谢
本研究得到了台湾国家科学技术委员会（NSTC113-2321-B-005-007和113-2311-B-001-035）的支持。
