基于计算机模拟方法筛选表皮生长因子受体(EGFR)突变体新型抑制剂的研究

《Cancer Treatment and Research Communications》：Towards identification of novel inhibitors of EGFR mutants through In-silico approach

　　

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的过表达是多种癌症进展的关键因素，使其成为治疗干预的重要靶点。本研究采用分子对接(molecular docking)技术，筛选针对野生型EGFR及其临床相关突变体（包括外显子19缺失突变和外显子19缺失/T790M/L858R耐药突变）的潜在抑制剂。研究人员使用CB-dock2计算工具系统筛选了9个化合物，包括5个不可逆酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)和4个小分子天然化合物，并基于ADMET(吸收、分布、代谢、排泄及毒性)和毒性预测谱分析了这些分子的药物相似性(drug-likeness)与毒性。测试化合物中，粉防己碱(Tetrandrine)、蝙蝠葛碱(Dauricine)和Olmutinib在野生型和突变型EGFR构象中均表现出较强的结合亲和力(binding affinity)，突显其作为有效抑制剂的潜力。研究结果与现有文献一致，强化了天然化合物和靶向抑制剂在对抗EGFR驱动型癌症中的重要性。结合CB-dock2分子对接、ADMET分析和Lipinski五规则(Lipinski's rule of five)的整合方法为初步药物候选物筛选提供了稳健框架，有望加速开发更精准有效的EGFR靶向疗法。本发现丰富了探索替代及精细化策略抑制EGFR致癌机制的研究体系，强调了计算方法在识别具有更高特异性和更低副作用的新型分子靶点中的价值。

论文解读：基于计算机模拟方法筛选EGFR突变体新型抑制剂的研究

该论文题为"Towards identification of novel inhibitors of EGFR mutants through In-silico approach"，由Pallavi Khodlan、Rajdeep Chakraborty、Tabarak Malik、Maninder Pal Singh、Priyanka Rajbhar、Praveen Kumar、Raj Kumar、Anand Mohan及Anil Kumar完成，发表于《Cancer Treatment and Research Communications》。

研究背景：

表皮生长因子受体(EGFR)是一种170 kDa的跨膜蛋白，参与细胞增殖、迁移、DNA合成及黏附等多种生物学过程。多种癌症中存在EGFR过表达，与不良预后相关，其激活促进恶性特征、抑制细胞死亡并促进转移。EGFR外显子19(exon 19)缺失突变是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)及口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)中常见的基因变异；EGFR T790M/L858R双突变则导致ATP结合亲和力升高、EGFR信号通路过度激活及对EGFR靶向治疗反应性降低，是临床上重要的获得性耐药机制。目前已上市的西妥昔单抗(Cetuximab)等单克隆抗体存在获得性耐药问题，且对激酶区突变效果不佳，而小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)可直接作用于胞内激酶域，更适合抑制突变及组成型活化形式的EGFR。尽管已有第一代至第三代EGFR-TKI，探索新型小分子抑制剂仍具重要意义，尤其是天然来源的生物活性分子日益受到关注。本研究旨在通过计算模拟方法评估5种不可逆TKI（Afatinib、Dacomitinib、Olmutinib、Osimertinib、Pyrotinib）和4种天然小分子（Curcumin、Tetrandrine、Quercetin、Dauricine）对野生型EGFR、EGFR exon 19缺失突变体及EGFR T790M/L858R双突变体的抑制潜力。

主要关键技术方法：

研究人员从PDB数据库获取野生型EGFR（PDB ID: 1M14）、EGFR exon 19缺失突变体（PDB ID: 7TVD）及EGFR T790M/L858R突变体（PDB ID: 5EDP）的晶体结构；从PubChem获取9个配体三维结构。使用CB-dock2（Cavity-detection guided Blind Docking）工具进行盲对接(blind docking)，以AutoDock Vina计算结合自由能(binding free energy, Gibbs free energy, ΔG)，并用Discovery Studio Visualizer 2024可视化相互作用。通过重对接(redocking)验证野生型体系（RMSD<1.5 ?为合格），对无共结晶配体的突变体结构采用PDBeFold进行结构比对验证保守性。使用SwissADME进行Lipinski五规则(Lipinski's rule of five)评估，使用pkCSM进行ADMET（吸收absorption、分布distribution、代谢metabolism、排泄excretion、毒性toxicity）性质预测。

研究结果：

3.1. Molecular Docking（分子对接）：

对接协议验证：野生型EGFR重对接RMSD值为1.0157 ?（<1.5 ?），证实对接程序可靠；突变体结构经PDBeFold比对，exon 19缺失突变体与野生型RMSD为0.83 ?（267个对齐残基），T790M/L858R突变体RMSD为0.61 ?（270个对齐残基），表明激酶折叠及ATP结合区高度保守，验证的对接方案适用于突变体。对接结果显示：野生型EGFR中Tetrandrine和Dauricine结合能均为-9.2 kcal/mol最优，Olmutinib为-8.5 kcal/mol最优TKI；EGFR exon 19突变体中Tetrandrine结合能-9.2 kcal/mol最优，Olmutine -8.3 kcal/mol；EGFR T790M/L858R突变体中Dauricine结合能-9.0 kcal/mol最优，Olmutinib -8.5 kcal/mol。Tetrandrine和Dauricine在三种受体上均展现强且稳定的结合亲和力，Olmutinib也表现持续较好的亲和力。Curcumin和Osimertinib对突变型亲和力较野生型下降；Afatinib和Dacomitinib结合适中且较一致；Quercetin对野生型较好而Pyrotinib对T790M/L858R稍好。各体系中关键接触残基分别为野生型LEU694、GLY695、SER696、ALA698、PHE699；exon 19突变体LEU718、GLY719、SER720、ALA743；T790M/L858R突变体LEU718、GLY719、SER720、GLY721、PHE723。配体与ATP结合口袋残基形成范德华力、氢键、碳氢键及π-烷基/π-π堆积等弱非共价相互作用共同稳定复合物。

3.2. Tetrandrine and Dauricine violate Lipinski's rule of five（Tetrandrine和Dauricine违反Lipinski五规则）：

SwissADME分析显示Tetrandrine（MW=622.75 Da，MR=186.07，违反分子量>500及摩尔折射率>130）和Dauricine（MW=624.77 Da，MR=188.02，同样两项违反）各违反Lipinski五规则两项；Quercetin和Curcumin无违反。但四种天然分子均满足至少两项标准，故进一步进行ADMET分析。

3.3. Prediction of ADMET profile（ADMET谱预测）：

选取结合好的Tetrandrine、Quercetin、Dauricine三种天然分子及Dacomitinib、Olmutinib两种TKI进行pkCSM预测。吸收方面：人肠道吸收率Tetrandrine最高（94.014%），五种均>77%；Caco-2渗透性Dacomitinib（log P_app=1.02）和Olmutinib（1.058）>0.9提示良好。分布方面：稳态表观分布容积(log VD_ss) Quercetin（1.559）和Dacomitinib（1.311）显示较好组织分布，Tetrandrine（-0.826）和Dauricine（-0.525）组织分布受限。血脑屏障(BBB)穿透性：Tetrandrine log BBB=-0.041最高。代谢方面：除Quercetin外均为CYP3A4底物；Dauricine和Dacomitinib、Olmutinib为CYP3A4抑制剂。排泄方面总清除率均相近，Tetrandrine略高（0.813 log ml/min/kg）。毒性方面：AMES毒性均为阴性；Dacomitinib和Olmutinib预测有肝毒性(hepatotoxicity)，三种天然分子无预测肝毒性。

讨论部分总结：

研究人员指出肠道吸收均较好，Tetrandrine吸收率最高；Quercetin和Dacomitinib组织分布佳，天然碱受限组织分布但安全窗可能更好；除Quercetin外多经CYP3A4代谢；Dacomitinib和Olmutinib虽吸收好但有肝毒性预测，天然化合物无肝毒性预测且安全性特征更均衡。Olmutinib对接结果与文献报道（-8.40 kcal/mol）吻合验证方法可靠性；Tetrandrine结合能与文献（-9.1 kcal/mol）接近；Dauricine略低于文献（-10.1 kcal/mol）但仍具强结合。研究首次在同体系中直接比较不可逆TKI与天然生物碱对多EGFR变异体的结合亲和力，为天然产物作为EGFR靶向或辅助剂提供依据，但需后续体外(in vitro)激酶抑制、细胞实验及体内(in vivo)药效毒理验证。

结论（翻译）：

本研究强调Dauricine、Tetrandrine和Olmutinib作为EGFR及临床相关突变体（包括EGFR exon 19缺失及EGFR激酶T790M/L858R突变）有效抑制剂的潜力。这些化合物对EGFR活性位点表现出强结合亲和力，提示其可能抑制酶活并阻断EGFR在癌症进展中的作用。它们符合Lipinski五规则且具有 favorable药代动力学特征，支持其作为药物开发候选物的适用性。尽管分子对接为药物-受体相互作用提供有价值的初步见解，但其固有局限是无法考虑生物系统动态性及潜在脱靶效应。因此这些发现应辅以严格的体外和体内实验来验证抑制活性及治疗效力。未来研究应聚焦于体外激酶抑制及细胞水平检测，继而在体内评估药代动力学、疗效和安全性，以促进将这些计算发现转化为潜在治疗应用。此类研究还将有助于阐明其抗癌作用机制、生物利用度及生理环境下的潜在副作用。这种整合策略可为开发新型靶向疗法铺平道路，为EGFR过表达或失调驱动的癌症治疗提供新希望。