《ACS Central Science》：Detecting Bacteria in Their Mammalian Hosts Using Metabolism-Targeted [13C]CO2 Breath Testing
编辑推荐：
为解决抗生素耐药时代对快速、无创细菌感染诊断方法的迫切需求，研究人员探索了多种静脉注射的细菌特异性13C标记代谢物，通过检测其代谢产生的[13C]CO2来诊断感染。研究表明，[U-13C]麦芽糖、d-[U-13C]甘露醇和l-[U-13C]阿拉伯糖在多种小鼠感染模型中可产生显著[13C]CO2信号，并能监测抗生素疗效。该技术为临床实践中识别细菌感染提供了一种独特的补充方法。
感染性疾病是全球范围内发病和死亡的主要原因之一。随着抗生素耐药性的日益加剧，高效、无创的诊断方法变得比以往任何时候都更加重要。传统的诊断手段，如聚合酶链式反应和细菌培养/药敏试验，有时无法立即提供结果。而像计算机断层扫描和磁共振成像这样的结构性成像技术，通常依赖于非特异性的结构异常，这些异常往往在病程晚期才出现，且可能与无菌性炎症等状况难以区分。因此，临床医学面临的一个关键挑战是快速、准确地区分侵袭性细菌感染与病毒性疾病或非感染性疾病。近年来，针对病原体特异性代谢途径的新型成像方法，如正电子发射断层扫描，展现出潜力。这些成像探针，例如氟-18标记的[2-18F]麦芽糖和d-[2-18F]甘露醇，能够区分急性细菌感染与无菌性炎症。然而，PET成像设备昂贵且不便携。有没有一种更简单、更经济的方法，也能利用细菌独特的“口味偏好”来发现它们呢？
受此启发，并借鉴临床上使用[13C]尿素呼气试验诊断幽门螺杆菌感染的思路，一个研究团队将目光投向了代谢靶向的[13C]CO2呼气检测技术。他们设想，如果给患者静脉注射一些细菌特别喜欢“吃”、但人类细胞基本不“碰”的、用稳定的碳-13同位素标记过的“特制食物”（代谢物），那么这些食物只会被体内的细菌代谢，并产生带有碳-13标记的二氧化碳([13C]CO2)。通过检测呼出气体中[13C]CO2的含量，就能像侦探一样，发现隐藏的细菌感染。这种方法有望成为一种便携、廉价的即时诊断工具，与现有方法形成互补。该研究成果发表在《ACS Central Science》上。
为了验证这一设想，研究人员主要运用了几项关键技术：首先，他们使用非分散红外光谱（NDIR）这种便携、廉价的桌面仪器，来检测细菌培养物和小鼠呼出气中的[13C]CO2浓度。其次，他们构建了多种小鼠感染模型，包括肌炎、菌血症、肺炎和骨髓炎，并在代谢舱中收集感染小鼠注射13C标记代谢物后的呼出气体进行检测。此外，研究还采用了生物发光成像来确认感染模型的成功建立，并通过组织匀浆和平板计数来量化细菌负荷。最后，他们将[13C]CO2呼气检测的结果与同源PET示踪剂[2-18F]麦芽糖的摄取进行了相关性分析，并利用化学酶法合成了新型13C标记代谢物[U-13C]清酒二糖。
体外筛选通用13C标记代谢物显示多种底物/病原体组合可产生[13C]CO2
研究人员首先在体外测试了多种市售的、全碳-13标记的代谢物，看它们能否被人类致病菌代谢产生[13C]CO2。他们发现，[U-13C]麦芽糖、[U-13C]麦芽三糖、d-[U-13C]甘露醇、l-[U-13C]阿拉伯糖和d-[U-13C]山梨醇能被多种革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）代谢产生[13C]CO2，而使用其天然丰度（12C）对应物时则未观察到[13C]CO2产生。这表明这些代谢物具有细菌特异性。
给未感染小鼠施用候选13C标记代谢物导致极少的[13C]CO2呼出
接下来，研究团队在未感染的小鼠体内筛选这些代谢物，以选择那些背景[13C]CO2产生水平低的分子。为了避免胃肠道中常驻细菌的干扰，他们采用了静脉注射方式。结果显示，静脉注射[U-13C]麦芽糖、[U-13C]麦芽三糖、d-[U-13C]甘露醇和l-[U-13C]阿拉伯糖后，未感染小鼠产生的[13C]CO2极少。而作为对照的d-[U-13C]葡萄糖和d-[U-13C]山梨醇则产生了强烈的信号，因为它们能被哺乳动物细胞代谢。这证明前几种代谢物在未感染宿主体内背景噪音低，具有用于体内检测病原体的潜力。
施用[U-13C]麦芽糖、d-[U-13C]甘露醇和l-[U-13C]阿拉伯糖导致感染小鼠[13C]CO2产量增加，且抗生素治疗后减少
在肌炎感染模型中，研究人员发现，与未感染小鼠或注射天然丰度对照物的小鼠相比，感染金黄色葡萄球菌的小鼠在注射[U-13C]麦芽糖后，[13C]CO2产量显著增加。同样，感染大肠杆菌的小鼠在注射d-[U-13C]甘露醇或l-[U-13C]阿拉伯糖后，也观察到了显著的[13C]CO2信号提升。更重要的是，在一项治疗实验中，感染大肠杆菌并引起肌炎的小鼠在接受头孢曲松治疗后，其由d-[U-13C]甘露醇产生的[13C]CO2信号显著下降，这与治疗后的细菌负荷减少相一致。这表明该技术可用于实时监测抗菌治疗效果。
使用d-[U-13C]甘露醇和[U-13C]麦芽糖的呼气试验识别了菌血症、肺炎和骨髓炎的临床前模型中的感染
为了探索该技术的广泛应用潜力，研究团队还在小鼠的菌血症、肺炎和骨髓炎模型中进行了测试。在大肠杆菌菌血症模型中，使用d-[U-13C]甘露醇成功检测到了感染。在金黄色葡萄球菌肺炎模型中，使用[U-13C]麦芽糖可检测到感染，而接种热灭活细菌的对照组则无信号。在骨髓炎模型中，感染后第4天和第8天使用[U-13C]麦芽糖均能检测到[13C]CO2产量增加，且信号强度与股骨中的细菌负荷相关。
MRSA培养物用[U-13C]麦芽糖处理产生的[13C]CO2与体外[2-18F]麦芽糖积累及体内[2-18F]麦芽糖信号相关
细菌特异性PET成像的一个挑战是不同菌株对示踪剂的摄取存在差异。研究人员假设，使用13C标记代谢物的呼气检测可作为筛查工具，预测其结构生化类似成像探针的性能。他们比较了四种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株对[2-18F]麦芽糖的摄取和用[U-13C]麦芽糖产生[13C]CO2的能力，发现两者趋势相似。随后在小鼠肌炎模型中的PET-CT成像和离体生物分布分析也证实，[13C]CO2产量高的菌株，其[2-18F]麦芽糖摄取和体内信号也更高。这表明呼气检测有可能预测同源PET示踪剂的成像效果。
化学酶法合成[U-13C]清酒二糖为[13C]CO2呼气检测扩展13C标记二糖提供了一条有前景的途径
受新型18F标记二糖用于病原体特异性PET成像的启发，研究人员通过化学酶法合成了新型代谢物[U-13C]清酒二糖。体外实验表明，所有测试的MRSA菌株在与此代谢物孵育后均产生了高水平的[13C]CO2，而使用天然丰度的清酒二糖或热灭活细菌则未观察到信号。这证明通过合成新型13C标记代谢物，可以进一步扩展呼气检测技术的“武器库”，以针对特定病原体。
研究结论与重要意义
本研究探索了利用静脉注射、细菌特异性13C标记代谢物进行[13C]CO2呼气检测，以诊断人类细菌感染的潜在应用。研究发现[U-13C]麦芽糖、d-[U-13C]甘露醇和l-[U-13C]阿拉伯糖等代谢物能在体外被多种病原菌高效代谢，但在未感染动物体内信号极低。这些代谢物利用NDIR光谱，可在肌炎、骨髓炎、肺炎和菌血症等多种小鼠感染模型中，通过呼出的[13C]CO2可靠地检测感染。此外，该技术还能通过d-[U-13C]甘露醇监测大肠杆菌感染对头孢曲松治疗的有效反应，显示了其在临床监测治疗效果、确定疗程方面的潜力。
该诊断概念的创新之处在于，它利用了近期在细菌代谢靶向PET示踪剂（如[2-18F]麦芽糖、d-[2-18F]甘露醇）方面的进展，但提供了一种更简单、便携且可能更经济的替代方案。麦芽糖、甘露醇和阿拉伯糖均已可安全地用于人体静脉注射，其13C标记类似物有望易于递送至患者。便携且廉价的集成腔输出光谱或NDIR光谱仪器可以很容易地融入医疗实践。
在临床实践中，侵袭性细菌感染（如细菌性肺炎、心内膜炎、椎间盘炎-骨髓炎、假体周围关节感染等）通常难以与病毒性或非感染性疾病区分，现有诊断方法存在局限。本研究证明，在多种临床前感染模型中均可产生细菌特异性的[13C]CO2信号，表明在人体中识别这些感染是可行的。[13C]CO2呼气检测技术有望与现有和新兴的诊断工具互补，提高广泛可用的实验室评估的特异性，在早期医疗评估中区分侵袭性细菌感染与病毒性或非感染性疾病。尽管未来临床试验仍需解决细菌负荷、生物膜、来自定植菌的背景信号以及符合药品生产质量管理规范的代谢物成本等挑战，但考虑到相关代谢物已有安全使用史、人体呼检测信号可能更强等因素，该技术前景乐观。
总之，这项研究拓展了代谢靶向诊断的应用范围，为无创检测细菌感染提供了一种基于[13C]CO2呼气检测的新方法。通过扩展具有潜在细菌检测特异性的13C标记代谢物库，并利用便携设备检测其转化，该技术有望成为一种安全、直接、可即时使用的工具，用于识别代谢异常，不仅限于细菌感染，未来也可能应用于癌症等其他疾病的检测。
