《Analytical Chemistry》：Comparison of Liquid Chromatography- and Nano-Electrospray Ionization-Mass Spectrometry Approaches for Single-Cell Metabolomics
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本研究针对活体单细胞代谢组学分析中，毛细管采样后应选择直接纳升电喷雾离子化-质谱（nano-ESI-MS）还是液相色谱-质谱（LC-MS）方法这一实际问题，开发并系统比较了两种半靶向代谢组学方案。研究以感染结核杆菌的巨噬细胞为模型，结果表明，即使在分析流条件下，LC-MS在代谢物覆盖范围、区分感染与未感染细胞的能力方面均优于nano-ESI-MS，并能更清晰地揭示感染引发的甲硫氨酸、半胱氨酸、牛磺酸等含硫代谢物重编程。该工作为空间分辨单细胞代谢组学建立了稳健的分析框架，在传染病研究、药物发现和临床诊断领域具有广泛应用潜力。
在生命科学的微观世界里，每个细胞都是一个独特的个体，它们的行为和状态并非千篇一律。传统的“批量”分析手段，如同将一杯混合果汁一饮而尽，只能尝到平均味道，却无法品鉴其中每一粒果肉的风味。单细胞分析技术正是为了揭示这种被掩盖的细胞异质性而生，而单细胞代谢组学（Single-Cell Metabolomics）作为其中一员，旨在捕捉单个细胞内小分子代谢物的实时快照，直接反映其最底层的生化活动状态。想象一下，如果我们能看清一个被病原体入侵的免疫细胞内部正在发生怎样的化学变化，或许就能找到制服病原体的新钥匙。然而，通往这一目标的道路上有道关键选择题：当研究者用比头发丝还细的玻璃毛细管“抓住”一个活细胞后，该如何最有效地解读其中的代谢奥秘？是选择快速直接、但可能“信号混杂”的纳升电喷雾离子化-质谱（nano-electrospray ionization-mass spectrometry, nano-ESI-MS）法，还是选择步骤稍多、但能“分门别类”的液相色谱-质谱（liquid chromatography–mass spectrometry, LC-MS）法？这两种主流技术路径孰优孰劣，在单细胞代谢组学领域此前并无定论。
为了解答这个悬而未决的问题，并建立更可靠的单细胞分析框架，研究人员在《Analytical Chemistry》上发表了一项开创性研究。他们以结核病研究为切入点，因为其致病菌结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）擅长潜伏在巨噬细胞内，与宿主细胞上演复杂的代谢“攻防战”。理解这场发生在单细胞层面的微观战争，对于开发新疗法至关重要。研究团队选取了THP-1单核细胞分化而来的巨噬细胞，并用表达红色荧光蛋白mCherry的卡介苗（Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin, BCG，结核分枝杆菌的减毒疫苗株）进行感染，建立了一个安全的宿主-病原体互作模型。通过对比感染与未感染（对照）巨噬细胞在单细胞水平的代谢差异，他们系统地评估了nano-ESI-MS与LC-MS两种方法在灵敏度、精密度、线性、代谢物覆盖度以及区分感染状态能力等多个维度的性能。
研究人员为开展此项比较研究，主要运用了以下几项关键技术：首先，利用商用自动化单细胞采样系统（Single Cellome SS2000），在共聚焦显微镜直视下，对活体状态下的单个感染或未感染巨噬细胞进行空间定位和毛细管精准吸取，确保了样本的“空间分辨率”和“活细胞”特性。其次，对同一样本平行建立了优化的nano-ESI-MS直接进样方法和HILIC（亲水相互作用色谱）-LC-MS色谱分离方法，并采用高分辨质谱（Orbitrap）进行检测。最后，运用多元统计分析（如偏最小二乘法判别分析PLS-DA）和火山图等生物信息学工具，对两种方法获得的海量单细胞代谢组数据进行深度挖掘和可视化比较，以评估其揭示生物学差异的能力。
Development of an Analytical Flow LC-MS Method for Targeted and Untargeted Single-Cell Metabolomics（针对靶向和非靶向单细胞代谢组学的分析型液相色谱-质谱方法开发）
研究人员首先建立并优化了用于单细胞分析的LC-MS方法。他们通过调整离子源参数、优选溶剂品牌、优化毛细管样品洗脱策略（“清洗”法回收率更高）以及提高质谱分辨率（140,000）等手段，成功提升了方法的灵敏度，并显著增加了在单细胞水平提取物中检测到的代谢物特征数量。
Development of a Nano-ESI-MS Method for Targeted and Untargeted Metabolomics（用于靶向和非靶向代谢组学的纳升电喷雾-质谱方法开发）
相应地，研究团队也优化了nano-ESI-MS方法，通过调整纳喷源位置和参数，并确定了140,000的最佳分辨率，以在单细胞样本中检测到最多的特征峰。
Comparison of Nano-ESI-MS and LC-MS Methodology Applied to Standards and Dilute Cell Extracts（纳升电喷雾-质谱与液相色谱-质谱方法在标准品和稀释细胞提取物中的应用比较）
通过对氨基酸标准品的校准曲线评估，LC-MS在灵敏度、精密度和线性方面均优于nano-ESI-MS。此外，在稀释至单细胞水平的THP-1代谢物提取物中，LC-MS检测到的特征数量也多于nano-ESI-MS。
Single-Cell Sampling and Analysis（单细胞采样与分析）
研究核心部分是对实际单个细胞的分析。他们成功采集并分析了20个感染和18个未感染的对照巨噬细胞（每种方法）。结果显示，在单细胞中，LC-MS检测到的质荷比（m/z）特征总数、可注释的分子式及已命名化合物数量均显著超过nano-ESI-MS。虽然两种方法共同检测到203种化合物，但LC-MS检测到的独特注释化合物比例（74%）远高于nano-ESI-MS（41%）。在代谢物类别覆盖上，LC-MS在大多数类别中检测到更多化合物，尤其擅长检测脂肪酸酰基等更大更复杂的分子，而nano-ESI-MS则在二嗪和唑类等小分子检测上稍具优势。
结果分析显示感染相关的代谢重编程
多元统计分析表明，LC-MS数据能更清晰地区分空白样本、对照细胞和感染细胞。与nano-ESI-MS数据中特征强度变异大、区分不明确相比，LC-MS数据显示感染细胞中富集了一簇明显的代谢物特征。火山图分析进一步揭示，LC-MS检测到感染与对照细胞间更多具有显著差异的代谢物特征，且分布更为均衡。特别重要的是，LC-MS成功检测到牛磺酸、胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸在感染巨噬细胞中显著富集，这些均是与硫代谢和氧化应激反应相关的化合物。相比之下，nano-ESI-MS未能检测到牛磺酸，且其余几种含硫氨基酸的差异也无统计学意义。这直接证明了LC-MS方法在揭示感染驱动的细微代谢变化方面具有更强大的能力。
综上所述，本研究首次在单细胞代谢组学层面系统比较了nano-ESI-MS和LC-MS两种技术路径。结论明确指出，尽管LC-MS分析时间更长（约15分钟/细胞）、样品前处理步骤更多（需从毛细管转移至样品瓶），并存在样品稀释问题，但其凭借色谱分离有效降低了离子抑制效应，从而在代谢物覆盖度、检测限以及区分生物学差异的能力方面均表现出显著优势。这使得LC-MS更适用于需要全面、深入代谢谱分析的单细胞研究。而nano-ESI-MS则以其快速（约2分钟/细胞）、样品处理简单、成本较低的特点，成为一种适用于快速筛查或高通量初筛的“鸟枪法”技术。两种技术各有优劣，互补而非互替，研究者可根据具体实验目标（追求速度还是深度）进行战略性选择。本研究建立的稳健分析框架，不仅为空间分辨活体单细胞代谢组学提供了方法论支持，其应用于结核分枝杆菌感染模型所揭示的硫代谢重编程，更彰显了该技术在解析感染驱动的代谢异质性、区分病原体-宿主直接相互作用与“旁观者”免疫效应等方面的巨大潜力，为传染病机理研究、新药发现和精准诊疗开辟了新的视野。
