《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：TM9SF4 acts as a receptor mediating Glaesserella parasuis cytolethal distending toxin–induced cytotoxicity in PK15 cells
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本研究旨在探究副猪格拉瑟菌（Glaesserella parasuis）主要毒力因子细胞致死膨胀毒素（GpCDT）的宿主细胞受体。研究人员通过Co-IP结合LC-MS/MS技术筛选并证实了跨膜蛋白TM9SF4与GpCDT特异性相互作用。基因敲除实验表明，TM9SF4的缺失可显著抑制GpCDT引起的细胞毒性，而过表达则会增强其毒性，从而首次确定TM9SF4是GpCDT在PK15细胞上的功能受体。这为深入阐明猪格拉瑟病的致病机制及开发靶向防治新策略提供了重要理论依据。
在猪的健康养殖中，有一种名为猪格拉瑟病（Gl?sser’s disease）的疾病，其病原是常驻于猪上呼吸道的副猪格拉瑟菌（Glaesserella parasuis）。这种细菌在猪只抵抗力下降时可“兴风作浪”，引发严重的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，给养猪业带来不小的损失。目前，疫苗和抗生素是主要的防控手段，但疫苗的交叉保护力有限，而抗生素耐药性问题日益严峻，让防控工作面临挑战。因此，深入剖析副猪格拉瑟菌的致病机制，寻找新的干预靶点，显得尤为重要。
在副猪格拉瑟菌的“武器库”中，细胞致死膨胀毒素（Cytolethal Distending Toxin, CDT）是其已知唯一分泌的外毒素，堪称“王牌武器”。这种毒素能进入宿主细胞，引发DNA损伤，导致细胞周期停滞、凋亡甚至“铁死亡”（ferroptosis），在致病过程中扮演关键角色。然而，任何毒素要发挥作用，第一步必须“登陆”——即与宿主细胞表面的特定“港口”（受体）结合。对于其他细菌（如大肠杆菌、伴放线聚集杆菌）的CDT，科研人员已发现N-连接糖蛋白、糖鞘脂乃至一些跨膜蛋白可能充当其受体，但副猪格拉瑟菌的CDT（简称GpCDT）究竟如何“登陆”，其神秘的“接应者”（受体）是谁，一直是个未解之谜。解开这个谜题，是系统阐明GpCDT细胞毒性机制、进而开发精准干预策略的关键。
针对这一科学问题，来自四川农业大学动物医学院猪病研究中心的研究团队，在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》期刊上发表了一项重要研究。他们的研究成果首次揭示，一个名为TM9SF4的跨膜蛋白，正是GpCDT在猪肾上皮细胞（PK15）上“登陆”并引发细胞毒性的关键受体。这项发现不仅填补了GpCDT作用机制研究的重要空白，也为未来开发针对猪格拉瑟病的新型防治策略提供了全新的理论靶点。
为了探寻GpCDT的受体，研究人员采用了系统而严谨的研究策略。他们首先利用共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）技术，从PK15细胞的膜蛋白中“钓取”可能与GpCDT结合的蛋白，再通过高精度的液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）进行分析，最终锁定了287个候选蛋白。结合亚细胞定位（位于细胞膜或细胞外）和基因本体（Gene Ontology, GO）功能分类，他们从中筛选出9个最有可能的“嫌疑人”进行进一步验证。
在验证过程中，研究人员运用了多种关键技术。他们通过基因编辑“神器”CRISPR/Cas9技术，构建了多个候选基因的杂合敲除PK15细胞系，并通过细胞活性（CCK-8）检测，快速筛选出对GpCDT毒性影响最显著的TM9SF4基因。随后，他们又通过有限稀释法获得了TM9SF4的纯合敲除（KO）细胞系，并通过慢病毒包装技术构建了TM9SF4稳定过表达（OE）的细胞系，从而拥有了功能“缺失”和功能“增强”的对比研究模型。为了直观展示TM9SF4与GpCDT的“亲密关系”，研究人员还进行了间接免疫荧光（Indirect Immunofluorescence Assay, IFA）实验，观察两者在细胞内的共定位情况。这些技术的综合运用，为最终锁定TM9SF4受体身份提供了多重、相互印证的证据链。
3.1 初步筛选出9个可能与GpCDT相互作用的宿主细胞蛋白
研究人员首先纯化了重组GpCDT蛋白。通过Co-IP结合LC-MS/MS分析，他们从PK15细胞中鉴定出287个在与GpCDT共孵育后显著富集的蛋白。通过分析这些蛋白的亚细胞定位，发现有58个位于细胞膜或细胞外空间。再结合GO功能分析（涉及信号转导、跨膜运输、受体复合物等功能），研究人员最终聚焦于9个候选蛋白，包括EPHB4、LITAF、TM9SF4、SLC12A4等，认为它们有潜力成为GpCDT的受体。
3.2 验证宿主细胞蛋白与GpCDT的相互作用
为了确认这9个候选蛋白是否真的能与GpCDT“牵手”，研究团队在HEK-293T细胞中表达了这些带有Myc标签的蛋白，并进行了反向Co-IP验证。结果清楚地显示，在9个候选蛋白中，有4个（EPHB4、LITAF、TM9SF4和SLC12A4）能够特异性免疫共沉淀GpCDT，而其他5个则未检测到相互作用。这初步证明这4个蛋白是GpCDT的直接结合伙伴。
3.3 EPHB4、LITAF、TM9SF4和SLC12A4基因杂合敲除对GpCDT毒力的影响
仅仅能结合还不够，关键要看这个结合是否对毒素的毒性至关重要。于是，研究人员利用CRISPR/Cas9技术，成功构建了这4个基因的杂合敲除PK15细胞系。当用不同浓度的GpCDT处理这些细胞系时，一个现象脱颖而出：只有TM9SF4基因的杂合敲除细胞（PK15ΔTM9SF4+/-）在所有测试浓度下都表现出对GpCDT毒性的显著抵抗，细胞存活率明显高于普通PK15细胞。相比之下，LITAF敲除的保护作用微弱，而EPHB4和SLC12A4的敲除反而使细胞对毒素更敏感。这一结果强烈提示，TM9SF4是介导GpCDT细胞毒性的关键因子。
3.4 TM9SF4作为宿主细胞受体介导GpCDT内化并诱导细胞毒性
基于以上发现，TM9SF4成为了研究的焦点。研究团队进一步构建了TM9SF4的纯合敲除（PK15-TM9SF4-KO）和稳定过表达（PK15-TM9SF4-OE）PK15细胞系。细胞毒性实验给出了更确凿的证据：KO细胞在面对GpCDT攻击时，存活率显著提高，且在显微镜下几乎看不到毒素引起的细胞病变效应（如细胞膨胀、死亡）；而OE细胞在低毒素浓度下则表现出更高的敏感性。这清晰地表明，TM9SF4的表达水平直接决定了细胞对GpCDT的易感性。
最后的“证据”来自视觉观察。间接免疫荧光结果显示，在普通PK15细胞和OE细胞中，标记为绿色的TM9SF4蛋白与标记为红色的GpCDT毒素在细胞膜及胞内内吞囊泡中存在强烈的共定位（显示为黄色），两者的皮尔逊相关系数高达0.936。而在KO细胞中，几乎检测不到GpCDT在细胞上的结合信号。这直观地证明了TM9SF4是GpCDT结合并进入细胞的“门户”。
综上所述，本研究通过系统的筛选和功能验证，首次提出并证实了跨膜蛋白TM9SF4是GpCDT在PK15细胞上的功能受体。TM9SF4对于GpCDT结合到细胞表面、进而内化并引发细胞毒性至关重要。缺乏TM9SF4的细胞能有效抵抗毒素攻击，而过表达TM9SF4则会增强细胞对毒素的敏感性。
在讨论中，作者将这一发现置于更广阔的背景下。TM9SF4属于跨膜蛋白9超家族，此前的研究已暗示其可能在病原体感染中发挥作用，例如在果蝇细胞中，TM9SF4的缺失会降低对某些革兰氏阴性菌的易感性。本研究不仅将TM9SF4与一种重要的细菌毒素直接联系起来，还为其在猪的病原体感染中的具体功能提供了首个证据。同时，作者也指出了本研究的局限和未来方向，例如尚不清楚TM9SF4是否与GpCDT的单个亚基（CdtA, CdtB, CdtC）结合，以及该受体在其他相关的猪宿主细胞（如气管上皮细胞或肺泡巨噬细胞）中是否发挥相同功能。此外，TM9SF4如何影响GpCDT诱导的具体细胞死亡方式（如凋亡、焦亡、铁死亡等）也有待进一步阐明。
尽管存在这些问题，本研究的结论是明确且具有重要意义的。它首次揭示了GpCDT入侵宿主细胞的“钥匙孔”，为从受体层面深入理解副猪格拉瑟菌的致病机理开辟了新路径。未来，针对TM9SF4受体或GpCDT与受体结合界面的干预策略，例如开发阻断性抗体或小分子抑制剂，有望成为预防和治疗猪格拉瑟病的新思路，从而为应对当前疫苗和抗生素面临的挑战提供潜在的替代方案。
