利用微CT成像技术检测南方绿臭虫（Nezara viridula）对大豆荚造成的隐藏体积变化

《Legume Science》：Detection of Hidden Volumetric Changes Caused by the Southern Green Stink Bug, Nezara viridula, on Soybean Pods Using Micro-CT Imaging

　　**摘要**

大豆（Glycine max L.）是一种重要的农作物，在人类营养和动物饲料中发挥着重要作用。刺吸式害虫正在威胁全球大豆种植的安全，主要通过其含有酶的唾液导致植物被刺部位变形和组织死亡。微计算机断层扫描（micro-CT）技术使我们能够无损地研究臭虫损害植物组织的详细解剖和形态变化。为了研究南方绿臭虫（Nezara viridula L., 1758）对大豆的取食影响，我们在豆荚上放置了0、3和5只臭虫，并在感染后的不同时间点拍摄micro-CT图像，以确定内部组织结构的变化。测量结果显示，N. viridula成虫在最初的24小时内取食了14.20次。成像清晰地显示了N. viridula造成的损害，表现为密度降低的区域。尽管各组之间的豆荚总体积没有差异，但内部组织的变化非常明显，这通过“空洞”体积（强度小于4000 a.u.的区域）的增加得以体现，这种变化与感染持续时间和严重程度相关。此外，通过对豆荚强度的直方图分析，在感染后24小时就发现了与损害相关的显著变化。我们可以推测，由酶引起的种子损害在取食后几天内会变得更加明显，其范围和严重程度都会增加。我们的研究结果有助于更客观地了解这种入侵性农业害虫的损害范围，并评估其实际的损害潜力。

**1 引言**

大豆（Glycine max L.）是一种重要的农作物，它直接供人类食用，在动物饲料中占据重要地位，并具有多种工业用途；未来几年其产量将面临日益增长的需求（Pagano和Miransari 2016）。昆虫害虫正在威胁全球大豆种植的安全；其中，刺吸式昆虫尤为重要（Gaur和Mogalapu 2018）。南方绿臭虫（Nezara viridula L., 1758）原产于非洲，现已分布于世界各地（Todd 1989）。如今，这种世界性物种被认为是危害大豆的最严重的害虫之一。作为一种高度多食性的害虫，它会对多种经济价值高的作物造成损害（Panizzi 2000；Panizzi等人2000；Sabljic等人2020；Saldanha等人2024；Todd 1989）。一般来说，刺吸式昆虫对寄主植物的偏好会随着植物物候期的变化而变化（Panizzi 2000；Panizzi等人2000）。最具吸引力的阶段是果实期，或者对于豆科植物来说，是豆荚形成期（Bundy和McPherson 2000；Lye和Story 1988；Todd 1989）。通过插入口针并释放含有酶的唾液，这些昆虫在植物组织外开始消化过程；预消化后的植物物质成为它们的食物（Labandeira和Phillips 1996）。臭虫对植物组织的损害表现为变薄、变形和组织死亡（Panizzi等人2000）。在豆科植物中，对生长中的豆荚的损害会导致种子发育不良，产生皱缩或变形的种子（Brier和Rogers 1991）。在后期损害中，种子上会出现黑色斑点，并伴有小凹陷（Todd和Herzog 1980）。当成熟的种子被切开时，这种损害会表现为穿刺点下方的白色组织。根据损害发生的时间，收获作物的质量、数量、种子发芽率和活力都可能受到影响（Jensen和Newsom 1972）。植物组织的损害是由N. viridula的特定取食策略引起的。这种昆虫会产生两种不同类型的唾液：一种胶状唾液，用于封闭穿刺部位并衬里口针的路径；另一种水性唾液，注入植物体内以溶解组织并提取植物汁液（Giacometti等人2020）。水性唾液中含有代谢物、蛋白质以及活性酶，如果胶酶、淀粉酶和蛋白酶（Giacometti等人2020）。由于大豆种子在成熟过程中会积累蛋白酶抑制剂，N. viridula更倾向于取食正在发育的种子（McGrain等人1992）。简而言之，细胞破坏是由口针的插入和注入的唾液引起的，这也导致远离穿刺通道的组织受到损害，形成广泛的撕裂区域。传统上，研究植物组织变化的方法包括使用切片和染色的光学显微镜或具有更高分辨率的透射电子显微镜（Le等人2019）。然而，这两种二维技术无法在空间上表征组织损害的程度。此外，由于这些方法是破坏性的，因此无法评估损害程度随时间的变化，因为它们不适合重复测试。微计算机断层扫描（micro-CT）是一种三维无损成像技术，用于可视化并测量不同样本的内部微观结构（Badea 2021）。该技术能够研究各种植物部分的解剖和形态特征，提供高分辨率的植物器官和组织体积图像（Karahara等人2023；Le等人2019）。由于其高分辨率，它可以用来评估种子的内部结构，以检测任何异常情况（Gargiulo等人2020）。其他无损成像技术在这种情况下适用性有限：光学方法仅限于表面特征，而磁共振成像由于干燥植物组织的水分含量低以及空气-组织界面的明显磁化率伪影而不适合使用。基于micro-CT成像的上述特性，它可以成为表征臭虫损害引起的植物内部结构变化的优秀方法（Fran?a-Silva等人2023）。本研究旨在使用micro-CT识别和评估N. viridula对发育中的大豆豆荚和种子结构造成的损害变化。我们的目标是分析损害的空间特征，并表征组织中病变大小的时间变化。此外，我们还希望使用基于micro-CT图像上可识别穿刺通道数量的新方法来确定N. viridula成虫的取食频率。

**2 材料与方法**

**2.1 实验设置**

来自商业品种“Annika”大豆（Agromag Ltd., Szeged, Hungary，中等成熟期品种，生长周期为145–148天）的种子在匈牙利Kozármisleny种植，行间距为0.75米（GPS：46.044780,18.276796）。田间未使用任何农药。为了保证一致性，从田间收集了处于R5阶段（豆荚填充期）的发育中的大豆豆荚。豆荚于2023年8月28日凌晨收集，并立即运输到microCT成像地点。运输和实验过程中，豆荚保持在受控条件下（温度：25±1°C，相对湿度：60±10%）。基线microCT成像从收集豆荚的当天开始。为了研究植食性对发育中的大豆豆荚的影响，从Kozármisleny市附近的农村地区收集了成年N. viridula昆虫。收集到的昆虫也保持在受控条件下（温度：25±1°C，相对湿度：60±10%，光照周期为15:9 L:D）。实验期间定期检查昆虫，提供水源，并及时更换死亡的昆虫。为了研究N. viridula的取食效果，我们在透明塑料盒（20×15×10厘米）中放置了0、3和5只臭虫在单个大豆豆荚上；每个处理重复五次。臭虫放置在大豆豆荚上后立即开始取食。随后，在感染后0、6、24、48和72小时分别拍摄micro-CT图像，以确定内部组织结构的变化。每次成像过程中，大豆豆荚会暂时从昆虫身上取下进行micro-CT扫描，扫描后立即放回实验装置。成像间隔期间，带有害虫的豆荚样本被重新置于具有相同非生物参数的受控条件下。

**2.2 图像采集与预处理**

CT图像使用Nikon XT H 225st微焦点CT系统采集，采集参数如下（1250次投影，每投影2张图像，160 kV，75 μA）。为了最大化吞吐量并确保相同的成像条件，同时扫描了五个来自同一处理的豆荚，方法是将三个豆荚放在下层，两个放在上层，中间用纸板隔开。纸板层还用作强度标准化的内部参考，使得不同扫描之间的任意强度单位（a.u.）值能够一致地重新缩放。扫描布局的3D重建如图7A所示（为了演示目的，分割的纸板已被移除）。重建的原始数据使用ImageJ（1.54f，美国国立卫生研究院）转换为Analyze格式（Schindelin等人2012）。图像被切成三部分；上部包含两个豆荚，下部包含三个豆荚。中间的纸板层用于标准化收集到的图像的任意原始强度。切割位置在ImageJ中确定，而将初始图像分为三部分的操作使用FSL的fslroi部分（版本6.0.7.4，FMRIB软件库；Jenkinson等人2012）完成。三个结果部分保存为NIfTI格式。使用scikit-learn库拟合高斯混合模型（GMM）来分离中间部分中的两类（空气和纸）。选择该模型是因为中间部分的体素强度分布明显呈双峰状，且该成像部分只包含两种材料（空气和纸）。随后，对分离后的直方图拟合了十次多项式，其最大值用于强度值的线性重新缩放（强度校准）。强度被标准化为空气0 a.u.，纸6500 a.u.，对应于两类之间观察到的最大强度差异，从而保持尽可能高的分辨率。区分空气和纸是后续两点强度标准化的关键步骤，因为这两种材料作为稳定的参考点，用于在多次扫描中调整任意扫描仪强度单位。在使用GMM验证每个中间部分的标准化后，上层和下层使用相同的常数进行归一化。预处理的最后一步是使用fslmaths（FSL 6.0.7.4，FMRIB软件库）将上层和下层各中心缩放两倍，最终得到40×40×40μm3的各向同性分辨率。在3D Slicer（版本5.8.1）中对豆荚进行单独分割，使用经验确定的初始强度阈值4000 a.u.以及随后的岛屿函数将两个或三个豆荚分割成不同的部分。手动校正后，将分割结果导出为二值标签图（NIfTI格式），同时还包括每个豆荚的3D模型（.stl格式）。由于豆荚中包含强度低于4000 a.u.的区域（空气和受损组织），导出的二值标签图中包含孔洞（0值）。为了计算这些低强度部分的体积和强度特性，并帮助后续的配准，使用fslmaths填充标签，并从填充和未填充的标签图中计算出空洞图，从而得到每个豆荚的三个二值标签图（pod、pod_filled和pod_void）。空洞标签表示豆荚的暗部（<4000 a.u.）。为了区分豆荚的整体收缩和局部低密度变化，使用了填充的豆荚掩模（pod_filled）和相应的空洞掩模（pod_void）。空洞区域（<4000 a.u.）包括自然存在的空气空间和受损组织，因此被解释为复合的低密度区域，而不仅仅是单纯的损害。通过比较感染豆荚和对照豆荚之间空洞体积的时间变化来推断与损害相关的效应。接下来，使用fslstats（FSL 6.0.7.4，FMRIB软件库）提取体积、平均强度、强度标准差、10%强度值、中位数和90%强度值，以便进一步进行统计分析。所有三个掩膜的强度直方图也导出，强度范围为0–12,288 a.u.，每个时间点每个豆荚有512个bin。应用的固定强度范围对应于重建图像的完整后归一化动态范围。所有豆荚和时间点都使用统一的512个bin计数，以确保数据集中强度分布的一致采样，并为高斯拟合提供足够的分辨率。在Matlab（MATLAB 2023b，马萨诸塞州纳蒂克：The MathWorks Inc.）中使用了自定义脚本（见支持信息）来处理导出的直方图：仅使用分布右侧的数据点（以8000 a.u.为中心的健康豆荚组织）拟合高斯曲线，并计算了整个高斯曲线下的面积以及整个直方图下的面积；最后计算了这两个面积的比率（直方图比率）并导出。参考约8000 a.u.反映了与完整豆荚组织相对应的主要高强度峰的大致位置；该峰是基于每个样本自动检测到的，在直方图比率分析中没有使用固定的强度阈值。使用MeshLab 2023.12通过刚性对齐每个时间点的3D模型来验证每个豆荚的身份，以排除由于样本架在成像体积中的偶然错位而导致的错误。接下来，使用fslmaths对填充的标签图进行膨胀处理，然后将膨胀后的图用于分离每个豆荚并创建仅包含单个豆荚的单独CT图像。使用这些单独的CT图像，所有豆荚都使用antsRegistrationSyN（Advanced Normalization Tools，v.2.5.2.post17-g116da52）与它们对应的初始时间点图像进行配准，以可视化由于虫害引起的局部组织损伤。通过3害虫处理，我们确定了进食频率（每只昆虫每天进食的次数）。使用3D Slicer软件，一名观察者使用所有三个正交平面手动计数和标记了穿透通道。为了提高检测的灵敏度，评估是在原始（未重采样的）图像上进行的，分辨率为20 × 20 × 20μm3。使用24小时样本中的所有五个可用豆荚来评估穿透通道的数量。这使我们能够确定每颗大豆豆荚在24小时内每只害虫的平均穿透通道数量。仅在3害虫处理中评估了进食频率，因为这种条件提供了足够的穿透事件以进行可靠计数，同时最小化了拥挤和穿透通道重叠的潜在混淆效应。

2.3 统计分析

所有分析都是使用GraphPad Prism（版本9.0.0(121)，GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行的。统计推断使用了重复测量双因素方差分析（two-way ANOVA），因变量为体积或直方图比率，因素为组和时间。通过测试正态性、异常值和球形性来判断重复测量双因素方差分析的假设是否满足。如果违反了球形性假设（差异的变异性相等，通过Mauchly检验评估），则应用了Geisser–Greenhouse校正，并将ε值包含在统计结果中。使用Tukey的多重比较检验进行了事后成对检验。每个单独的大豆豆荚被视为一个独立的生物重复。对于每个处理组（对照组、3只害虫、5只害虫），在0、6、24、48和72小时时对五个豆荚进行了纵向分析并重复成像。每个豆荚没有生成技术重复，并且从相同的生物单元获得了随时间的重复测量。所有基于体积和直方图的指标都是在豆荚级别提取的。对照组的直方图比率下降通过带有Geisser–Greenhouse校正的重复测量单因素方差分析进行评估（图5）。p值<0.05被认为是统计上显著的。

3 结果

3.1 CT成像

N. viridula害虫造成的损伤表现为明显的强度降低，主要在种子内部可见。在我们的实验中，这些区域的强度值远低于健康豆荚组织中的值。从质量上看，观察到的损伤可能是明显的且广泛的，特别是在严重虫害（五只N. viridula）的后期时间点。请参见图1，其中包含了实验开始时（图1A）和实验开始后72小时（图1B）的5只害虫组的代表性示例。图1显示了5只N. viridula在72小时内造成的损伤程度。上排（A）显示了大豆豆荚的基线外观。下排（B）显示了与上排图像配准的同一豆荚的图像。受损组织表现为低强度区域。

3.2 豆荚体积

通过重复测量双因素方差分析（F(2,12) = 2.212, p = 0.1521）在观察的时间点，三个组（对照组、3只害虫、5只害虫）的填充（总）豆荚体积之间没有显著差异。组*时间交互作用也不显著（F(8,48) = 0.1265, p = 0.9978）。根据分析，豆荚体积随时间显著减少（F(1.655,19.86) = 6.829, p = 0.0078, Geisser–Greenhouse的ε = 0.4137）。见图2。图2显示了豆荚体积随时间的变化。所有三个组都显示出总体积随时间的类似减少，但组间没有显著差异。对照组（绿色）和3只害虫组（蓝色）的平均初始豆荚体积略大于5只害虫组（红色），但差异不显著。

3.3 空洞体积

从48小时时间点开始，豆荚内的空洞体积（强度低于4000 a.u.的区域，代表空气和受损组织）在组间显示出显著差异，见图3中的小提琴图。重复测量双因素方差分析显示了组、时间和时间*组的显著效应（F(2,10) = 7.969, p = 0.0085, F(1.313,13.13) = 52.91, p < 0.0001, ε = 0.3282, 和 F(8,40) = 8.952, p < 0.0001）。观察到的差异主要是由于在48小时和72小时时间点，五只害虫组与三只害虫组和对照组样本之间的空洞体积差异较大（p = 0.0089–0.0388，事后成对Tukey检验）。图3显示了不同时间点三个组中空洞体积的分布。绿色图表显示了对照组样本中的空洞体积分布，而蓝色和红色图表分别代表3只害虫组和5只害虫组。显著差异用星号标记（Tukey的事后检验）。*p < 0.05, **p < 0.01。

3.4 直方图比率

在所有样本中，对健康豆荚组织的原始直方图值进行高斯曲线拟合的效果非常好（R2 ≥ 0.99）。图4显示了5只害虫组在基线（图4A）和48小时（图4B）的直方图比率计算示例。图4显示了原始强度值的分布。原始直方图数据用蓝线表示，而红线表示高斯拟合的结果。直方图比率是黄色区域与直方图总面积（黄色+绿色）的比率。图A显示了5只害虫组在基线时的样本分布，而图B显示了同一豆荚在48小时时的情况。图5展示了随时间变化的组间直方图比率差异。虫害程度对直方图比率下降有显著影响（ANOVA组效应：F(2,12) = 19.19, p = 0.0002）。从24小时开始可以明显观察到差异；5只害虫组的下降最为明显，其次是3只害虫组，而对照组样本随时间没有显著下降。图6显示了在测量时间点进行的直方图比率的事后成对比较结果。从虫害开始后的24小时起，5只害虫组的样本与对照组豆荚显示出高度显著的差异（p = 0.0006在24小时，p < 0.0001在48小时和72小时）。较低的虫害程度（3只害虫）也导致与对照组豆荚相比直方图比率显著降低（p = 0.0304和p = 0.042分别在48小时和72小时），而更多的害虫数量在48小时时也导致直方图比率降低（p = 0.0409），并且在72小时时也显示出强烈趋势（p = 0.0582）。图5显示了随时间变化的组间直方图比率差异。3只害虫（蓝色）和5只害虫（红色）样本的直方图比率与对照组样本（绿色）相比都有明显的下降。对照组样本的直方图比率没有下降（F(1.558,6.6231) = 2.454, p = 0.1661, ε = 0.3894）。图6显示了在测量时间点（0、6、24、48、72小时）进行的直方图比率的事后成对比较。从24小时开始可以观察到显著差异。两个受害虫组在后期时间点（48小时和72小时）的直方图比率都有显著下降。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。图7显示了虫害程度对所有三个组代表性豆荚的影响。图7C和D分别显示了3只和5只N. viridula/豆荚的组织损伤，而图7B显示了同一时间点的对照组豆荚。组织损伤程度（给定时间点与0小时初始测量值之间的体素强度差异）使用3D Slicer的标准彩虹LUT（红色>黄色>绿色）进行颜色编码，绿色代表最高程度的组织损伤。图7显示了三个检查组中的组织损伤。（C、D）分别显示了3只和5只害虫组的组织损伤。配准的图像与不同时间点的计算组织损伤图叠加。地图使用3D Slicer的标准彩虹LUT从红色到绿色进行着色（红色>黄色>绿色），绿色代表最高程度的组织损伤。（B）同一时间点的对照组豆荚。（A）豆荚在其原始成像位置的三维模型（分隔上下行的纸板未在图像中建模）。

3.5 进食频率

在三种害虫处理的情况下，24小时进食后每个大豆豆荚的平均穿透通道数量（N = 5）为42.60（±3.07）。进食频率（每只昆虫/24小时的进食次数）为14.20。图8显示了CT图像上的穿透通道。穿透通道（用红色箭头标记）显示为穿过豆荚壁的狭窄、低强度线条。

4 讨论

微CT成像清楚地识别了N. viridula对大豆造成的损伤，因为受损组织的密度与健康组织的密度有显著差异。尽管在整个实验过程中保持了受控条件，但大豆豆荚的总体积持续减少，但所有三个组之间的减少程度相似，组间没有统计学上的显著差异；没有由于实验设置引起的总体积变化。这种持续的变化可能是由于收集的豆荚收缩所致。5只害虫组的平均总体积（豆荚填充）略低于其他两个组，但在任何时间点，这种差异都没有统计学意义，表明观察到的内部组织损伤对总体积没有影响。与总体积不同，“空洞”体积（强度低于4000 a.u.的区域体积）在三个组中的变化不同。它在5只害虫组中的增加速率最高，从48小时开始与对照组和较低害虫组有显著差异。总体而言，我们的结果证实，N. viridula对大豆豆荚造成的几天内的损伤在总体积减少或视觉上明显的损伤（病变、变色）方面是不可见的。然而，豆荚内部发育的种子由于半翅目昆虫的进食活动而发生了显著的体积变化。在当前研究中，尽可能仔细地进行了高级标准化处理，但尽管如此，此类评估仍存在固有的局限性：不充分的标准化可能导致可靠性和灵敏度的降低（Kocio?ek等人，2020年）。因此，评估扩展了一种基于直方图的方法，该方法对标准化的准确性不敏感；这使我们能够在更早的时间点捕捉到组间差异，并且在48小时和72小时时也捕捉到3只害虫受损样本与对照组豆荚之间的组间差异。由于没有任意阈值，鲁棒性得到了进一步增强。从直方图比率估计中，我们可以得出结论，尽管害虫放置在豆荚上后立即开始进食（通过肉眼观察：在实验箱中和6小时CT扫描中），但在CT扫描上观察到的组织损伤可能在之后变得更加明显，这是N. viridula唾液酶的长期破坏性作用的结果。尽管我们已经知道酶在组织损伤的发展中起主要作用（Fran?a-Silva等人，2023年），但关于损伤发展的动态知之甚少。基于这项研究，我们可以假设酶引起的种子损伤在害虫进食后的几天内变得更加明显，无论是范围还是严重程度都在增加。与我们的研究结果相反，早期研究报告称N. viridula造成的损伤深度为1.2毫米（Depieri和Panizzi 2011）。然而，Depieri和Panizzi使用的侵染时间较短（60分钟），且侵染对象是成熟且被水浸泡的大豆，这些大豆中富含营养的组织（胚乳）位于种皮正下方。相比之下，我们的研究对象是仍保存在新鲜采集的豆荚中的种子，需要更深的刺穿才能到达胚乳。取食频率在生物学上具有重要意义，因为每次取食都会对豆荚组织造成机械性破坏，并注入富含酶的唾液，从而累积性地促进损伤的发展。因此，较高的取食频率预计会增加内部损伤的程度和严重性。我们测定的N. viridula成虫的取食频率为每天14.20次，略高于先前文献中报道的数值。Panizzi研究了N. viridula在不同发育阶段的取食行为，发现幼年成虫的最大取食频率为每天10次（Panizzi 1995）。观察到的差异可能有多种原因。一方面，研究方法不同：Panizzi使用立体显微镜（经过染色处理后）观察受损的大豆种子，并通过计数刺针鞘在植物表面的初始部分（通常呈球状的部分）来确定取食频率（Panizzi 1995），而我们则观察了豆荚壁内的穿透通道。另一方面，上述研究使用的是成熟且被水浸泡的大豆种子，而我们使用的是处于发育中的豆荚，这是N. viridula最偏好的食物之一。此外，还需要注意的是，在开始微CT成像之前，运输和实验设置过程可能干扰了昆虫的取食行为，这可能导致它们在研究的前24小时内出现轻微的饥饿状态，从而增加了它们的食欲。我们的研究客观地展示了微计算机断层扫描技术在客观绘制N. viridula以及其他具有类似刺吸口器的半翅目昆虫造成的隐藏损伤方面的潜力。在所有情况下，先前确认的营养成分降解都伴随着体积变化和受损种子数量的减少（Rivera和Mitchell 2020）。我们的研究结果有助于更客观地了解这种危险入侵性农业害虫的损伤范围及其实际危害潜力。从实际应用的角度来看，基于微CT的方法并不旨在取代高通量的工业种子分选系统（由于成本、时间要求和辐射暴露等明显原因），但可能有助于开发更新、更先进的分选技术。该方法提供了一种客观、无损的参考方法，用于量化外部视觉检查无法检测到的隐藏内部损伤。这些详细的体积和直方图为基础的损伤指标可以作为验证新开发的快速筛选技术的基准，包括目前用于种子质量评估的光学、光谱或低剂量成像方法。所有这些都将为我们奠定一个健康、完整的植物蛋白基础，这对动物饲料和人类营养至关重要。

作者贡献：
Szilvia Gibicsár：概念化、研究设计、数据管理、项目协调、初稿撰写、审稿与编辑。
Tamás Donkó：数据分析、监督、审稿与编辑。
ádám Csóka：数据分析、审稿与编辑。
András Kovács：资源提供、审稿与编辑。
Gergely Orsi：数据分析、审稿与编辑。
Sándor Keszthelyi：概念化、监督、审稿与编辑。

致谢：
我们衷心感谢Szentkút Agro Ltd.为我们提供实验场地。

资金支持：
本研究得到了匈牙利文化与创新部EK?P-MATE/2024/25/D新国家卓越计划的支持，该计划资金来源于国家研究、开发与创新基金。此外，本研究还得到了匈牙利农业与生命科学大学旗舰研究小组计划的支持。

利益冲突：
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明：
支持本研究结果的数据可向通讯作者[S.G.]索取，如有合理需求。