构建赤霉素可逆调控的双用系：基于ZmKO1基因的玉米两系杂交制种新体系

《Plant Biotechnology Journal》：Engineering a Gibberellin-Switchable Dual-Use Line Based on Ent-Kaurene Oxidase Gene ZmKO1 Enables Two-Line Hybrid Seed Production in Maize

本研究针对玉米杂交制种中现有雄性不育系统存在效率低、成本高、存在转基因风险等问题，聚焦于开发一种稳定、可逆且非转基因的雄性不育新策略。研究人员通过鉴定和功能解析一个由赤霉素(GA)合成通路关键酶基因ZmKO1突变导致的新型雄性不育突变体(def1)，构建了一种“赤霉素开关”双用系(GDL)。该系在自然条件下表现为雄性不育，可用于杂交制种；而外源喷施GA3即可高效恢复其育性，从而实现不育系自身的快速繁育。该研究成功建立了基于ZmKO1的GDL系统，并将其应用于杂交种“川单99”的生产，为解决玉米杂交育种中长期存在的技术瓶颈提供了一种创新、经济且环境友好的两系法解决方案。

　　

在农业生产中，利用作物的杂种优势是提高产量的有效途径，而实现规模化、高效且低成本的杂交种子生产，则是这项技术商业化的关键。玉米作为雌雄同株异花作物，本应是杂交制种的“模范生”，但在实际操作中，为了阻止母本自交，传统上往往需要投入大量人力进行“去雄”——摘除母本植株的雄穗。这项工作不仅劳动强度大、成本高昂，还会对植株造成损伤，影响产量，甚至可能因去雄不彻底导致种子纯度下降。有没有更“聪明”的办法呢？

利用雄性不育系作为母本，理论上可以一劳永逸地解决去雄难题，从而大幅降低生产成本并保证种子纯度。然而，理想的雄性不育系“可遇而不可求”。细胞质雄性不育(CMS)存在恢复系窄、易感病等问题；而由核基因控制的隐性雄性不育(GMS)虽然稳定，但其不育系的繁殖却成了大麻烦——既然它自己不能产生花粉，那如何让它“传宗接代”以扩大群体呢？生物技术的发展带来了转机，例如利用除草剂诱导不育的“Roundup杂交系统”，或通过转基因保持系来繁殖非转基因不育系的“种子生产技术”，但它们或依赖转基因，或存在基因漂移风险，在推广和应用上仍有诸多限制。因此，开发一种稳定、高效、非转基因且易于操作的雄性不育新系统，成为玉米育种家们孜孜以求的目标。

这篇发表在《Plant Biotechnology Journal》上的研究，带来了一线曙光。研究人员从一个太空诱变的玉米群体中发现了一个奇特的突变体，并将其命名为def1。这个突变体雄穗上的小花总是紧闭不开，花丝无法伸长，花药也藏在里面不出来，导致完全不能散粉，表现为雄性不育。但显微镜下的观察却揭示了一个有趣的现象：它的花粉本身发育是正常的，活力与野生型没有差别。这暗示着，问题可能出在让花粉“抛头露面”的最后一步——花丝的伸长和花药的开裂上。经过精细的基因定位和图位克隆，研究人员找到了罪魁祸首：一个名为ZmKO1的基因发生了功能丧失性突变。这个基因编码的是一种名为柯巴基焦磷酸合酶(ent-kaurene oxidase, KO)的酶，而KO是植物体内合成一种关键激素——赤霉素(Gibberellin, GA)通路上的一个关键“齿轮”。原来，def1的“羞涩”是因为体内GA合成出了问题。

研究没有止步于基因鉴定。科学家们进一步证明，ZmKO1的功能缺失确实导致雄穗中多种活性GA（如GA₁, GA₃, GA₄, GA₇）的水平显著降低。而最令人兴奋的发现是，这种由“缺素”导致的不育是完全可逆的。当研究人员给def1植株外源喷施GA₃后，紧闭的小花绽放了，短缩的花丝迅速伸长，健康的花粉被成功释放出来，植株恢复了完全的育性。这意味着，同一个遗传材料，在自然条件下是理想的不育系，而在喷施赤霉素后，就能变身为可自交繁殖的保持系，具备了一种梦寐以求的“双用”属性。基于此，研究人员将这种材料命名为“赤霉素可逆调控的双用系”(Gibberellin-switchable Dual-use Line, GDL)。

为了将这一发现转化为实用技术，研究团队运用分子标记辅助回交和CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功将ZmKO1突变导入到多个具有不同遗传背景的优良玉米自交系中，创制了一系列ZmKO1基GDL。田间试验在四川、宁夏、新疆、云南、甘肃、海南等多个生态点进行，结果表明，这些GDL在不同遗传背景和多样环境下均表现出稳定的雄性不育性，而外源喷施GA₃后，其育性恢复也高效可靠。这证明了该系统的鲁棒性。此外，对比试验表明，GDL本身及其所配制的杂交种，在株高、穗位、产量等主要农艺性状上与对照均无显著差异，说明该不育性状并未带来不良的连锁效应。

最终，研究人员建立了一套完整的基于GDL的玉米两系杂交制种体系，并成功应用于杂交品种“川单99”的种子生产。该体系仅需在繁殖不育系时喷施廉价的赤霉素，而在杂交制种田则无需任何处理，操作简便，成本极低。

本研究主要运用了以下关键技术方法：首先，通过基于图位的克隆(Map-based cloning)结合遗传互补、CRISPR/Cas9基因敲除和EMS突变体验证，确定ZmKO1是def1表型的致病基因。其次，利用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)定量分析了雄穗中赤霉素及其前体物质的含量。再者，通过比较转录组学分析了野生型、def1突变体及GA₃处理后的def1在雄穗中的基因表达差异。此外，还运用了亚细胞定位、GUS(β-葡萄糖醛酸酶)组织化学染色、石蜡切片、花粉活力检测等实验技术对基因功能和表型进行解析。研究材料来源于空间诱变群体、EMS突变体库以及四川农业大学玉米研究所收集的种质资源。

3.1 def1 是一个单基因控制的隐性GMS突变体

def1突变体表现为完全雄性不育，其雄穗小花紧闭、花丝不伸长、花药不外露，但花粉发育过程和活力正常。遗传分析表明其受单个隐性核基因控制。

3.2 def1 是由ZmKO1基因功能丧失突变导致

精细定位将突变位点锁定在1.24-Mb区间内，测序发现ZmKO1基因第一个外显子存在一个大片段插入，导致蛋白质翻译提前终止。通过遗传互补实验、CRISPR/Cas9敲除创制的等位突变体以及EMS突变体的验证，均证实ZmKO1功能丧失是导致def1雄性不育的原因。

3.3 ZmKO1 将GA生物合成与雄性育性调控联系起来

亚细胞定位显示ZmKO1蛋白定位于质体。激素检测发现def1雄穗中多种GA含量显著降低。关键的是，外源喷施GA₁、GA₃、GA₄或GA₇均可完全恢复def1的育性。转录组分析发现，一批响应激素的基因（包括多个SAUR基因）在def1中表达下调，而GA₃处理可使其上调。

3.4 ZmKO2 同样作为GA生物合成通路中的KO发挥作用

与ZmKO1不同，ZmKO2基因主要在营养生长阶段高表达。敲除ZmKO2会导致植株严重矮化并产生无花粉的雄性不育，其幼苗中GA含量显著降低，且矮化表型可被外源GA₃挽救。这证明ZmKO2也是一个有功能的KO，并揭示了ZmKO1和ZmKO2在调控植株高度和育性方面存在功能分化。

3.5 在玉米中创制基于ZmKO1的双用GMS系

通过分子标记辅助回交和CRISPR/Cas9编辑，在多个遗传背景下成功创制了ZmKO1基GDL。这些品系在自然条件下稳定不育，喷施GA₃后高效恢复育性，且不育性对主要农艺性状无显著影响。

3.6 基于ZmKO1的双用GMS系实现了玉米的两系杂交制种

建立了GDL的高效繁殖规程（在60%植株吐丝时喷施约150 mg/L GA₃）。利用GDL作为母本与常规父本杂交，所配制的F₁代杂交种育性和农艺性状正常。最终，成功构建了GDL系统并应用于杂交种“川单99”的种子生产。

研究结论与重要意义

本研究首次在玉米中鉴定并功能解析了GA合成关键酶基因ZmKO1，发现其功能缺失导致一种独特的花丝伸长缺陷型雄性不育，且该不育可通过外源GA处理完全逆转。这一特性使得基于ZmKO1的突变体成为一种理想的“双用”材料。研究人员进而建立了名为“赤霉素可逆调控双用系”的玉米两系杂交制种新体系。

该GDL系统的成功创建具有多重重要意义：

1. 1.
   解决了GMS系繁殖难题：利用GA处理这一简单农艺措施，实现了不育系自身的高效繁殖，打破了核隐性雄性不育在应用上的核心瓶颈。
2. 2.
   技术优势明显：与现有CMS、RHS、SPT/MCS等系统相比，GDL系统具有非转基因、无基因漂移风险、恢复谱广、育性稳定、操作简便、成本低廉、环境友好等综合优势。其亲本及杂交种均为非转基因，易于被市场和监管接受。
3. 3.
   为杂交育种提供了创新工具：该体系不依赖转基因技术，通过常规育种结合分子辅助选择即可快速将优良不育性状导入不同自交系，加速了育种进程。
4. 4.
   具有潜在普适性：研究表明该策略在玉米近缘种Coix中初步可行，提示基于KO基因构建GDL系统的思路可能适用于其他作物，为作物杂交育种技术革新提供了新思路。

总之，这项研究不仅深入揭示了ZmKO1/ZmKO2在玉米GA合成和生长发育中的分工与功能，更重要的是，它将基础研究发现转化为一项具有重大应用潜力的育种技术，为玉米乃至其他作物的杂交种子生产提供了一种全新的、强有力的解决方案。