《Plant Biotechnology Journal》：SlMYB17 Antagonises the SlCBF Pathway to Negatively Regulate Tomato Chilling Tolerance
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本研究关注低温对番茄生产的严重限制，研究人员聚焦转录因子SlMYB17在番茄冷响应中的调控功能。通过构建过表达和CRISPR/Cas9突变体材料，结合ChIP-seq、Y1H、BiFC、DLR、VIGS等多技术手段，揭示了SlMYB17通过直接结合并抑制冷调控（COR）基因表达，并与SlCBFs蛋白互作抑制其转录激活活性，从而在转录和蛋白活性双层面拮抗SlCBF途径，负调控番茄耐冷性的分子机制。该研究为培育耐冷番茄新品种提供了重要遗传资源和新靶点。
想象一下，一种原产于热带的鲜美果实——番茄，当它离开温暖的故乡，面对低于冰点的环境时，会遭遇怎样的挑战？低温是限制番茄等热带作物广泛种植和生产力的主要环境胁迫之一。尽管设施栽培能够在一定程度上缓解这种限制，但提升番茄内在的耐冷性，才是实现其在寒冷气候下稳定高产的根本且可持续的途径。番茄作为一种对冷害高度敏感（0°C–12°C）的作物，其耐寒性远不及拟南芥等模式植物。为了应对低温，植物演化出了一套复杂的分子响应网络，其中C-重复结合因子（C-repeat-Binding Factor, CBF）途径扮演着核心角色。在番茄中，SlCBF1、SlCBF2和SlCBF3这三个高度同源的转录因子被低温快速诱导，它们共同调控着一系列下游的冷调控（cold-regulated, COR）基因，从而启动植物的冷适应程序。然而，这个关键通路如何被精确调控，特别是是否存在强有力的“刹车”因子，以及这些因子如何作用于CBFs，是理解并最终改造番茄耐冷性的关键科学问题。
尽管近年来科学家们已鉴定出一些调控番茄冷反应的转录因子，如正向调控因子SlICE1、SlWRKY33、SlMYC2，以及负向调控因子SlNAC3、SlWRKY34等，但对于R2R3-MYB类转录因子在番茄冷响应中的系统性研究，尤其是在全基因组水平上鉴定其靶基因网络，仍存在大量空白。此外，在育种实践中，识别适合基因编辑的负调控因子，通过敲除或削弱其功能来快速提升作物抗逆性，具有极大的应用潜力。那么，在番茄庞大的MYB转录因子家族中，是否隐藏着这样一个调控CBF途径、决定耐冷性强弱的关键“负调节器”呢？这正是发表在《Plant Biotechnology Journal》上的这项研究试图回答的核心问题。
为了回答上述问题，研究人员运用了多项关键分子生物学与生物化学技术。首先，他们从低温响应的RNA-seq数据中筛选候选基因，并利用农杆菌介导的遗传转化技术构建了SlMYB17的过表达和CRISPR/Cas9基因编辑突变体番茄植株，为表型与分子机制研究提供了关键材料。其次，他们利用染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）技术，在全基因组范围内鉴定了SlMYB17的直接靶基因。再者，通过酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）和染色质免疫共沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）验证了SlMYB17与特定靶基因启动子的直接结合。此外，研究还采用了双分子荧光互补（BiFC）、体外pull-down、双荧光素酶报告基因（DLR）等实验，证实了SlMYB17与SlCBFs蛋白间的相互作用及其对SlCBFs转录活性的抑制。最后，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术在野生型和slmyb17突变体中沉默SlCBFs基因，从遗传学上验证了SlMYB17的功能依赖于SlCBF途径。
2.1 SlMYB17抑制番茄的耐冷性
研究人员从低温响应的转录因子中筛选出SlMYB17，并构建了其过表达株系。表型分析显示，与野生型相比，SlMYB17过表达植株在低温胁迫后表现出更严重的叶片损伤、更高的离子渗漏、更低的最大光化学效率（Fv/Fm）和改变的OJIP荧光瞬变曲线，表明其耐冷性显著降低。同时，这些植株中SlCBF1-3基因的低温诱导表达水平也受到抑制。相反，利用CRISPR/Cas9技术获得的slmyb17突变体（携带9-bp缺失）则表现出显著增强的耐冷性，并且SlCBFs基因的诱导表达水平升高。这些结果初步证明SlMYB17是番茄耐冷性的一个负调控因子。
2.2 通过ChIP-seq分析鉴定SlMYB17的靶基因
为了全面解析SlMYB17的调控网络，研究团队对pSuper:SlMYB17-GFP转基因植株进行了ChIP-seq分析。结果显示，SlMYB17的结合信号主要富集在转录起始位点附近，其识别的核心基序为“(C/T)ACC(T/A)A(C/A)”。共鉴定出2023个在两个生物学重复中都存在的特异性靶基因。基因本体（GO）富集分析表明，这些靶基因广泛参与发育过程、代谢过程、转录调控和胁迫响应等，提示SlMYB17在协调番茄发育与胁迫适应中扮演关键角色。重要的是，靶基因列表中包含了SlCBFs以及多个COR基因，如SlCOR27b和WCOR413。
2.3 SlMYB17负调控SlCOR27b和WCOR413的表达
研究人员进一步聚焦于COR基因的调控。他们发现SlCOR27b和WCOR413在SlMYB17过表达植株中的低温诱导表达被下调，而在slmyb17突变体中则被上调。通过Y1H、ChIP-qPCR和EMSA实验，证实SlMYB17能够直接结合到SlCOR27b和WCOR413的启动子特定区域（包含“ACCTA”基序）。DLR实验则显示，共表达SlMYB17可显著抑制由SlCOR27b和WCOR413启动子驱动的荧光素酶报告基因活性。这些结果证明SlMYB17是SlCOR27b和WCOR413的直接转录抑制子。
2.4 SlMYB17拮抗SlCBF诱导的COR基因转录激活
既然SlMYB17和SlCBFs都能调控相同的COR基因，它们之间是否存在交叉对话？通过BiFC和体外pull-down实验，研究证实SlMYB17在细胞核内与SlCBF1、SlCBF2、SlCBF3均存在直接相互作用。DLR实验表明，SlCBFs能够激活SlCOR27b和WCOR413启动子，而共表达SlMYB17则可以显著抑制SlCBFs的这种激活作用。这意味着SlMYB17不仅直接抑制COR基因，还通过蛋白互作干扰SlCBFs的转录激活功能，从而在蛋白活性层面拮抗SlCBF途径。
2.5 SlMYB17负调控冷响应的功能依赖于SlCBF途径
为了从遗传学上确认SlMYB17与SlCBFs的功能关系，研究人员利用VIGS技术在野生型和slmyb17突变体中同时沉默了SlCBF1-3基因。结果显示，在野生型背景下沉默SlCBFs会加剧植株的冷敏感性。至关重要的是，在原本耐冷性增强的slmyb17突变体中沉默SlCBFs后，其增强的耐冷性几乎被完全消除，变得与SlCBFs沉默的野生型植株一样敏感。这一结果强有力地证明，SlMYB17负调控番茄耐冷性的功能，在遗传上依赖于完整的SlCBF途径。
综上所述，这项研究系统性地揭示了一个全新的番茄耐冷性负调控机制。该研究得出结论：R2R3-MYB类转录因子SlMYB17是番茄CBF途径的一个关键“刹车”。在分子机制上，它实施“双重打击”：首先，在转录水平，SlMYB17直接结合到COR基因（如SlCOR27b和WCOR413）的启动子上，抑制它们的表达；其次，在蛋白活性水平，SlMYB17进入细胞核与SlCBF1/2/3蛋白发生物理互作，从而抑制SlCBFs对其下游COR基因的转录激活能力。遗传学证据（VIGS实验）最终确认，SlMYB17的负调控功能完全依赖于SlCBF途径。因此，低温可能通过降低SlMYB17的表达，解除其对COR基因转录和SlCBFs活性的双重抑制，从而增强植物的耐冷性。
这项研究的意义重大。首先，在基础科学层面，它丰富了对植物（特别是番茄）低温信号转导网络的理解，揭示了MYB转录因子通过拮抗核心CBF途径来精细调控胁迫应答的新模式，并提供了全基因组水平的SlMYB17靶基因图谱，为后续研究MYB因子在发育与胁迫交叉对话中的功能提供了宝贵资源。其次，在应用层面，研究发现的slmyb17突变体（特别是两个9-bp缺失的等位基因）在保持基本正常生长发育和结实的同时，表现出显著增强的耐冷性，这使其成为利用基因编辑技术培育耐冷番茄新品种的极佳遗传材料。通过靶向修饰SlMYB16的编码区或调控其表达，有望在不影响农艺性状的前提下，有效提升番茄对低温逆境的适应能力，对于保障番茄的稳定生产和扩大种植区域具有重要的实践价值。
