过水液相色谱(Per-aqueous liquid chromatography, PALC)和/或弱离子交换色谱(Weak ion exchange chromatography, IEX)作为分离中性、酸性和碱性溶质的绿色分析技术

《Journal of Chromatography A》：Per-aqueous liquid chromatography and/or weak ion exchange chromatography as a green analytical technique for the separation of neutral, acidic and basic solutes

　　

摘要：研究人员采用主要为亲水作用色谱(Hydrophilic interaction chromatography, HILIC)设计的多种极性固定相，考察了使用高含水、无毒且环境友好型流动相的过水液相色谱(Per-aqueous liquid chromatography, PALC)的机制及应用潜力。以一系列低分子量简单酸性、中性和碱性溶质探究固定相特性。对带电溶质而言，离子交换(Ion exchange, IEX)为主要的保留机制，疏水效应及极性柱面的直接吸附亦有一定贡献。IEX是一种被忽视的机制，因流动相性质有利，值得在分析分离中进一步研究。尽管预测多点相互作用会导致峰形变差，腺苷一磷酸等腺苷单核苷酸(MW≈500)仍获得良好峰形。PALC应被视为一项新技术还是经典机制的组合尚存争议。

论文解读：过水液相色谱(PALC)与弱离子交换色谱对中性、酸性和碱性溶质分离机制及绿色分析应用研究

该研究由David V. McCalley、S.M.C. Buckenmaier与J. Heaton发表于《Journal of Chromatography A》。目前反相液相色谱(Reversed-phase liquid chromatography, RPLC)广泛使用乙腈(Acetonitrile, ACN)、甲醇等有毒有机溶剂及三氟乙酸(Trifluoroacetic acid, TFA)等含氟添加剂，存在环境与健康隐患。虽已有用碳酸二甲酯替代ACN或微型化色谱以减少溶剂消耗的研究，但未完全消除毒性溶剂。过水液相色谱(Per-aqueous liquid chromatography, PALC)使用高比例水含少量有机溶剂（通常＜10% v/v ACN）的流动相，多在裸硅胶或HILIC型极性固定相上操作，探索保留—有机相浓度U形曲线的高水相端，区别于HILIC在高有机相下形成水层进行亲水分配的机制。先前研究表明PALC对阳离子有离子保留作用，但不同HILIC型固定相对酸、碱、中性溶质混合分离的保留机制、适用"更绿色"溶剂（如异丙醇Isopropanol, IPA）及较大生物分子（如核苷酸）的表现尚待系统阐明。研究人员旨在明确PALC在不同极性固定相上的保留机制，评估IPA替代ACN的可行性，并拓展至腺苷单磷酸(Adenosine monophosphate, AMP)、腺苷二磷酸(Adenosine diphosphate, ADP)、腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate, ATP)等核苷酸的弱阴离子交换(Weak anion-exchange, WAX)分离，论证其作为绿色分析技术的潜力。

主要关键技术方法：使用Agilent 1290超高效液相色谱仪(Ultra-high performance liquid chromatography, UHPLC)，配备二元泵、自动进样器与光电二极管阵列检测器；选用6种100 mm × 2.1 mm i.d.色谱柱——Cortecs裸硅胶（1.6 μm核壳Superficially porous particle, SPP）、Titan裸硅胶（2.0 μm全多孔Fully porous particle, FPP）、BEH Amide（酰胺键合FPP）、PentaHILIC（五羟基键合SPP）、BEH Z-HILIC（磺基甜菜碱Zwitterionic键合FPP）、Torus DEAE（二乙氨基乙基Weak anion exchanger, WAX FPP）；流动相以重量配制，含5–10 mM甲酸铵(Ammonium formate, AF)或乙酸铵(Ammonium acetate, AA)缓冲液，pH 3.0或pH 8.8～9.0，有机改性剂为ACN、IPA或甲醇(Methanol, MeOH)；测试溶质涵盖中性（甲苯Toluene、尿苷Uridine、咖啡因Caffeine、茶碱Theophylline）、弱/强碱（普鲁卡因胺Procainamide、去甲替林Nortriptyline、氯化三甲基苯基铵Trimethylphenyl ammonium chloride, TMPAC）、弱/强酸（3-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、对二甲苯磺酸p-xylenesulfonic acid, p-XSA、苯磺酸Benzenesulfonic acid, BSA）及腺苷(Adenosine)、AMP、ADP、ATP；通过保留时间、塔板数（半峰宽法）及峰形评价，用Marvin软件计算Log D与电荷。

3.1. PALC separations on different HILIC-type columns. Overview of separations

研究人员在10% ACN / 5 mM AF pH 3.0条件下于6种HILIC型柱上测试酸、碱、中性溶质保留。结果显示所有柱均产生保留，表明PALC机制普遍存在；带电溶质以离子交换(IEX)为主导机制，中性极性溶质可能有极性吸附贡献，裸硅胶与部分残留阳离子位点的PentaHILIC对阴/阳离子分别表现特异保留/排斥或吸引，证实混合模式保留。

3.2. Retention of non-polar neutrals

研究人员发现甲苯在部分柱上保留时间(0.75–2.2 min)显著超过HILIC模式下 Void volume标记物行为，说明甲苯在PALC高水相中被部分保留，不宜作死时间标记物；BEH Amide柱上中性芳烃洗脱顺序与RPLC一致，提示存在疏水保留（可能与硅氧烷键Siloxane或键合间隔臂有关）。

3.3. Retention of polar and ionised basic solutes in PALC

研究人员观察到Cortecs与Titan裸硅胶柱对质子化碱（Procainamide、Nortriptyline、TMPAC）保留显著增强，归因于pH 3.0下硅醇基(Silanols)部分解离带负电产生阳离子交换作用；两柱选择性相似，核壳与全多孔差异影响小；Nortriptyline在BEH Amide上有异常高保留源于其疏水桥联乙基的疏水作用，而更亲水的碱无此现象；中性极性溶质（如Uridine）保留普遍较低。

3.4. Retention of acidic compounds

研究人员发现裸硅胶柱因表面负电排斥阴离子，对酸性溶质几乎无保留；具阳离子交换基团柱（Torus DEAE）在pH 8.8 / 10% IPA条件下对强弱酸均有良好保留与峰形；PentaHILIC（预期中性五羟基相）反常对阴离子有强保留、对阳离子弱排斥，推测合成残留氨基带来正电位点实现弱阴离子交换；酸性溶质保留随电离度增大（p-XSA > 羟基苯甲酸）而增强。

3.5. Effect of the organic solvent: Column efficiency

研究人员在BEH Amide柱比较ACN、IPA、MeOH的影响，10% IPA与10% ACN保留与柱效（半峰宽法）相近，IPA毒性低（USP Class 3 vs ACN Class 2）可作更环保替代；5%有机相比10%显著降低Nortriptyline保留印证疏水机制参与；MeOH不能洗脱Nortriptyline说明极性溶剂不易破坏该疏水作用；DEAE柱上无有机相亦可分离阴离子但峰形略差，少量有机改善峰形与选择性；提高pH降低DEAE氨基质子化减弱阴离子保留以调节出峰。

3.6. Analysis of larger more complex structures-application to separation of mononucleotides

研究人员选用耐高pH BEH DEAE柱(pH 9.0, 10 mM AA ± 10% IPA)分离Adenosine、AMP、ADP、ATP，获良好峰形（9,000–16,000 plates/m），洗脱顺序为Adenosine < AMP < ADP < ATP，保留随磷酸根负电荷增多而增强，符合弱阴离子交换机制而非HILIC亲水分配（高水相无HILIC水层）；提高AA浓度或去除IPA对保留次序影响小，疏水贡献弱；高pH同时抑制金属—核苷酸络合。

讨论与结论翻译：

使用附带IEX基团之极性HILIC型柱，PALC法可实现阳离子、中性及碱性溶质分析，保留机制含离子交换、疏水作用等；HILIC中亲水分配不参与，macromolecule高水相中无法形成离散水层，极性溶质可能发生极性吸附。疏水保留源自裸硅胶硅氧烷/桥联乙烯基或键合间隔臂。推荐少量异丙醇(IPA)作改性剂，其毒性显著低于ACN与MeOH。该分离无需高浓度无机盐或离子对试剂，利于电喷雾电离质谱(Electrospray ionization, ESI-MS)检测。除简单酸/碱/中性溶质机制研究外，腺苷磷酸酯获良好峰形，保留随溶质电荷增加（磷酸基数增多）而增强，反驳多点相互作用必致峰形恶化的预测。核苷酸在PALC流动相中溶解度高于HILIC之高ACN溶解液。当PALC指含微量有机改性剂流动相同时分析不同类型溶质（带电与中性）产生多重相互作用时可沿用PALC称谓；单一类型带电溶质之IEX分离应称离子交换色谱。弱离子交换色谱因可减少有毒改性剂与试剂使用——尤当使用ESI兼容低浓度缓冲液时——值得给予更多关注。