在天然配体和治疗性配体存在的情况下，利用LC-MS/MS技术对人类血清中总可溶性BCMA（B细胞成熟抗原）进行定量分析

《Journal of Chromatography B》：Quantification of total soluble BCMA from human serum in the presence of natural and therapeutic ligands by LC-MS/MS

BCMA可溶性抗原血清检测新方法及其临床应用，采用LC-MS/MS结合尿素裂解和有机溶剂沉淀技术，有效消除APRIL、BAFF及治疗性单抗干扰，实现3-1000ng/mL范围内高灵敏度定量，为BCMA靶向疗法剂量优化提供可靠生物标志物。

　　

克拉克·M·亨德森（Clark M. Henderson）|阿兰·马丁（Arlan Martin）|大卫·奥尔蒂斯（David Ortiz）|安东尼·J·李（Anthony J. Lee）|肖娜·M·亨格尔（Shawna M. Hengel）

作者撰写本文时，Pfizer公司位于美国。

摘要

B细胞成熟抗原在多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）细胞中高度表达，是该疾病治疗的理想靶点。这种蛋白质的细胞外域常从浆细胞表面脱落，释放出可溶性抗原，这种抗原被认为是一种潜在的治疗生物标志物，可用于评估疾病负担和病情活动度。可溶性BCMA水平的升高可能导致靶向药物分布（Target Mediated Drug Disposition, TMDD），从而干扰抗BCMA的多发性骨髓瘤生物制剂的作用。此外，天然配体和治疗性配体的存在会增加用于监测这种可溶性抗原的生物标志物检测的复杂性和难度。本文描述的LC-MS/MS方法利用尿素破坏配体结合，随后通过有机溶剂沉淀去除高分子量蛋白质，从而从血清中富集可溶性BCMA，同时消除天然配体和治疗性配体的干扰。该方法具有足够的灵敏度，可以从100微升血清中定量总可溶性BCMA，分析范围为3–1000 ng/mL。在存在天然配体APRIL和BAFF以及治疗性单克隆抗体的情况下，所有质控水平的平均回收率为101% ± 6.1%；该方法在不同质控水平下的准确率在91%到110.4%之间。该方法已按照GLP（Good Laboratory Practice）标准进行了验证，使用该方法获得的总sBCMA数据被用于开发模型，以指导一项针对复发性或难治性多发性骨髓瘤的新型单克隆抗体的临床研究中的剂量确定。

引言

多发性骨髓瘤（MM）是一种克隆性浆细胞疾病，约占所有血液系统恶性肿瘤的10%，其特征是骨髓中异常浆细胞过度增生[1]。B细胞成熟抗原（BCMA）受体主要表达在由B淋巴细胞衍生的浆细胞上，在浆细胞的存活和分化过程中起关键作用。BCMA抗原在多发性骨髓瘤细胞中高度表达，是新型疗法的理想靶点[2]。针对BCMA的免疫疗法已在复发性或难治性多发性骨髓瘤患者中显示出疗效和安全性[2]。

BCMA的细胞外域可通过γ-分泌酶的蛋白水解作用脱落，释放出可溶性BCMA（sBCMA），后者随后可以在血清中被检测到[3]。事实上，与健康个体或其他类型恶性肿瘤患者相比，多发性骨髓瘤患者的sBCMA水平较高[2]。较高的sBCMA血清水平与疾病负担和肿瘤负荷相关，并被提议作为疾病活动度的潜在生物标志物[3]。对于针对BCMA的免疫疗法，sBCMA水平的升高会导致抗BCMA疗法的靶向药物分布（TMDD），从而降低其与骨髓瘤细胞的结合[4]。

传统上，由于多发性骨髓瘤患者体内的sBCMA浓度较低，通常使用配体结合检测方法（如ELISA）来测量其水平[3]。然而，由于天然BCMA配体（如APRIL和BAFF）以及抗BCMA治疗药物的存在，这些检测方法可能会受到干扰，导致结果不明确。虽然分析治疗前样本可以消除治疗药物的干扰，但天然配体在治疗前和治疗后的样本中仍然是一个挑战。实际上，常用的人类BCMA ELISA检测方法会受到重组APRIL和BAFF的干扰，这些物质的浓度低于在多发性骨髓瘤患者群体中观察到的水平[5][6]。此外，我们还在一种用于监测治疗中患者样本以调整剂量的配体结合检测方法中观察到，针对BCMA的治疗性单克隆抗体也会产生干扰。

本文介绍了一种基于质谱的新方法，该方法采用溶剂萃取技术来克服天然配体和治疗性配体的干扰，从而富集低分子量蛋白质，能够以亚微克水平测量人体血清中的总sBCMA。这种方法不需要制备专门的免疫亲和试剂[7]，因此更易于应用，也更具灵活性，适用于低分子量蛋白质的定量。

该方法已根据GLP指南进行了验证[8]，并用于一项针对BCMA的新型多发性骨髓瘤治疗药物的临床试验中。该方法生成的数据被用于开发动力学模型，以指导该临床研究中的剂量调整。

方法概述

化学物质和试剂

所有化学品均从[1]购买，除非另有说明。稳定的同位素标准（SIS）内标肽在C末端含有重赖氨酸[ (¹³C)₆H₁₂(¹⁵N)₂O, Δmass = +8 amu]或精氨酸[ (¹³C)₆H₁₂(¹⁵N)₄O, Δmass = +10 amu]残基，未标记的对应肽来自New England Peptide（马萨诸塞州加德纳）。混合性别大鼠血清来自BioreclamationIVT（纽约州韦斯特伯里）。重组人可溶性BCMA、APRIL和BAFF来自Peprotech（新泽西州克兰伯里）。

利用夹心ELISA检测tMAb存在下的游离sBCMA

最初尝试使用夹心ELISA配体结合检测方法来测量游离sBCMA。但在开发过程中发现该方法无法满足稀释线性要求。在这些实验中，将sBCMA以恒定浓度加入血清中，并在不同浓度下滴定tMAb，以评估其与可溶性抗原的等摩尔结合情况。例如，当sBCMA在血清中的浓度为100 ng/mL时，tMAb的浓度分别为1、100、600和3000……

结论

对于接受抗BCMA治疗的多发性骨髓瘤患者，sBCMA的存在可能导致靶向药物分布（TMDD），使治疗药物无法与细胞靶点结合，从而降低治疗效果。因此，有必要监测这种可溶性抗原的浓度以准确确定剂量。然而，天然配体APRIL和BAFF以及抗BCMA治疗药物的存在可能会干扰使用相同配体的检测方法。

披露

所有在动物身上进行的实验均符合相关法规和既定指南，并经过了机构动物护理和使用委员会或伦理审查流程的审查和批准。

作者贡献声明

克拉克·M·亨德森（Clark M. Henderson）：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、方法学设计、数据管理、概念构思。 阿兰·马丁（Arlan Martin）：方法学设计、数据管理。 大卫·奥尔蒂斯（David Ortiz）：撰写 – 审稿与编辑、监督工作、数据管理、概念构思。 安东尼·J·李（Anthony J. Lee）：撰写 – 审稿与编辑、监督工作、概念构思。 肖娜·M·亨格尔（Shawna M. Hengel）：撰写 – 审稿与编辑、监督工作、方法学设计、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。