Biophysical characterization of spCas9 binding and cleavage using real-time electronic biosensors 利用实时电子生物传感器对spCas9结合与切割进行生物物理表征

《Sensors & Diagnostics》：Biophysical characterization of spCas9 binding and cleavage using real-time electronic biosensors

　　

CRISPR–Cas9技术可实现治愈性基因组编辑，但需要对靶标识别进行精确控制，尤其是在单核苷酸多态性（SNP）影响特异性的情况下。传统的生化和光学检测通常依赖于终点或整体平均测量，因此无法解析导致脱靶相互作用的实时结合动力学。在此，研究人员报道了一种无标记、非法拉第电化学阻抗光谱（nfEIS）平台，该平台利用金微电极直接监测spCas9–gRNA相互作用，并在镰状细胞病（SCD）位点实现了单碱基分辨率。研究人员设计了一种引导RNA（gRNA），使其与SCD突变（A到T）完美匹配，同时与野生型DNA（WD）序列在PAM近端引入单个错配。利用代表SCD和WD靶标的63核苷酸合成DNA底物，进行了浓度依赖性结合实验以提取平衡参数。Hill模型分析显示，SCD靶标具有更高的亲和力（kD= 0.09 nM），而WD的亲和力较低（kD= 0.3 nM），证实了强的靶向结合以及在错配位点的相互作用减弱。镁依赖性评估表明，5 mM Mg2+通过稳定靶向复合物同时破坏错配结合增强了区分度，而在1 mM Mg2+下这种选择性丧失。使用1 nM spCas9的时间分辨动力学测量和曲线指数拟合显示，SCD具有快速的缔合（t1/2= 1.85 min）和解离速率（t1/2= 5.24 min），这与有效的R环形成一致。相比之下，WD靶标表现出较慢的缔合（t1/2= 2.68 min）和反复的瞬时结合以及延迟的解离（t1/2= 34.38 min），这得到了终点凝胶实验的证实。缺乏gRNA的Cas9仅显示出微弱、不稳定的相互作用。总体而言，这些结果表明Cas9的特异性源于亲和力差异和结合驻留动力学。因此，nfEIS为探究Cas9保真度、Mg2+依赖性激活以及治疗性基因组编辑和诊断中的gRNA设计提供了一个实时、无标记的平台。

该研究针对CRISPR-Cas9系统在临床应用中面临的脱靶效应控制难题，利用非法拉第电化学阻抗谱（nfEIS）技术，对化脓链球菌Cas9（spCas9）在镰状细胞病（SCD）位点的结合与切割动力学进行了深入的生物物理表征。研究人员通过构建金微电极传感器，实现了在无标记条件下对spCas9–gRNA复合物与DNA相互作用的实时监测，重点揭示了镁离子浓度和单碱基错配对Cas9结合动力学及特异性的调控机制。研究结果表明，nfEIS技术能够精确量化spCas9的结合亲和力、协同系数及驻留时间，为优化基因组编辑工具和指导RNA（gRNA）设计提供了关键的动力学参数。此项工作成功将nfEIS应用于CRISPR系统的实时动态监测，确立了其在高保真基因组编辑和分子诊断中的应用潜力。

在关键技术方法方面，研究人员主要采用非法拉第电化学阻抗谱（nfEIS）作为核心检测手段，结合激光切割与溅射镀膜技术制备了三电极金微电极传感器。通过在金工作电极表面固定化硫醇修饰的双链DNA（dsDNA），并利用半胱氨酸进行表面钝化以减少非特异性吸附。实验利用Hill方程拟合浓度依赖性的阻抗数据以计算解离常数（k_D）和Hill系数（h），并采用单指数函数模型对时间序列阻抗数据进行拟合，从而独立量化spCas9–gRNA复合物的缔合与解离速率常数及半衰期。此外，研究还通过凝胶迁移实验验证了spCas9的序列特异性切割活性，并以不同镁离子浓度作为变量探究其对靶标识别的调控作用。

传感器质量控制与表面功能化

研究人员对所有传感器进行了严格的基线稳定性筛选，确保在去离子水与测量缓冲液交换过程中极化电阻（R_p）发生至少80%的下降，以保证电极的清洁度和导电性。通过Randles电路拟合发现，dsDNA固定化和半胱氨酸封闭后，传感器的极化电阻显著降低，而双层电容（C_p）未发生显著变化，证实了薄而致密分子层的成功构建，且未显著干扰有效双电层。

MgCl₂和Cas9浓度对Cas9与靶标结合的影响

凝胶迁移实验证实了spCas9–gRNA核糖核蛋白（RNP）能够选择性切割完全匹配的SCD底物，而对种子区域存在单碱基错配的野生型（WD）底物几乎不切割。nfEIS分析显示，在5 mM MgCl₂条件下，SCD表面表现出相对正的极化电阻偏移，表明稳定的靶向复合物形成；而WD表面则表现出相反的阻抗响应。当MgCl₂浓度降至1 mM时，这种区分能力丧失。浓度梯度实验表明，SCD靶标的表观结合亲和力（k_D）高达0.09 nM，Hill系数为1.14，显示出轻微的正协同性；而WD和仅含Cas9的对照组则表现出较弱的非特异性吸附和负协同性（h < 1）。

Cas9活性的动力学分析

通过分离缔合相和解离相对时间分辨nfEIS数据进行独立拟合。结果显示，完美匹配的SCD序列具有最快的缔合速率（K₁= 0.374 min^?1，半衰期 = 1.85 min）和中等的解离速率（K₂= 0.132 min^?1，半衰期 = 5.24 min），表明其能高效进行R环形成与催化激活。相比之下，单错配的WD序列虽然缔合较慢，但其解离过程极为缓慢（半衰期 = 34.38 min），表明错配将spCas9捕获在一种线性或部分拉链的R环状态，形成了一种虽紧密结合但无法激活HNH核酸酶结构域的动力学陷阱。无gRNA的Cas9仅表现出弱且短寿命的非特异性相互作用。

结论

综上所述，nfEIS测量结合平衡结合分析和时间依赖性单指数动力学拟合，揭示了spCas9与完美匹配及错配DNA靶标相互作用的显著差异。研究发现，完美匹配的SCD序列表现出最强的亲和力（k_D= 0.09 nM），支持快速的靶标识别和适中的驻留时间，这与高效的R环形成和产生活力一致。相反，WD错配尽管亲和力仅略弱（k_D= 0.3 nM），但显示出更慢的初始结合和显著延长的驻留时间，表明形成了一种瞬态但反复结合的无效复合物，起到了动力学陷阱的作用。单独的Cas9仅显示微弱、短寿命的相互作用，证实了gRNA在建立特异性和稳定DNA结合中的关键作用。重要的是，MgCl₂浓度在调节spCas9区分SCD和WD的能力中发挥了关键作用。在5 mM MgCl₂下，靶向SCD复合物被稳定，而错配的WD相互作用保持不稳定，实现了清晰的单核苷酸区分。然而，在1 mM MgCl₂下，这种区分丧失，表明Mg²⁺强烈影响spCas9–gRNA复合物的催化激活和选择性。这些发现共同表明，spCas9的特异性不仅受亲和力支配，还受结合动力学和R环状态的Mg²⁺依赖性稳定的差异支配。因此，nfEIS为解析CRISPR基于基因组编辑应用中的生产性 versus 非生产性Cas9–DNA相互作用提供了一个强大的无标记平台，并在评估gRNA特异性、脱靶易感性和诊断方面具有重要潜力。