Isoliquiritigenin（异甘草素）通过调节TNF信号通路并靶向IL-6来缓解乙醇引起的胃溃疡

《Journal of Functional Foods》：Isoliquiritigenin alleviates ethanol-induced gastric ulcers by modulating the TNF signaling pathway and targeting IL-6

　　严莉|杨进|舒万芬|李和荣|张创|王晓欢|张国坤|何秀月|李子瑜|罗敏|刘文
中国贵州省贵阳市贵州医科大学药学院，邮编561100

**摘要**
酒精性胃溃疡是一种临床上常见的胃肠道疾病，其发病机制与乙醇直接引起的黏膜损伤以及随后的炎症反应密切相关。异甘草素（ISL）是甘草中的主要生物活性黄酮类化合物，具有抗炎和抗氧化作用。本研究探讨了ISL对乙醇诱导的胃溃疡（GU）的保护作用及其机制。结果表明，ISL显著减轻了大鼠和胃上皮细胞的胃溃疡。转录组分析发现了470个被ISL逆转的差异表达基因，这些基因主要与炎症反应和TNF信号通路相关。RT-qPCR验证了这些发现，Western blot证实ISL抑制了TNF通路中的关键蛋白。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析显示IL-6是该网络中的核心蛋白。分子对接、动力学模拟和生物层干涉测量法证实了ISL与IL-6之间的强结合。总之，ISL对乙醇诱导的胃溃疡具有保护作用，其潜在机制可能涉及TNF通路，通过调节这一关键的炎症信号通路来减少细胞凋亡和胃黏膜损伤。本研究将ISL这种来自食物的成分确定为一种新型的辅助治疗剂，支持其在临床管理中的应用。

**1. 引言**
酒精性胃溃疡的全球患病率约为10%，属于最常见的慢性胃肠道疾病之一，给中国乃至全球带来了沉重的疾病负担（Li等人，2021；Li等人，2022）。该病以上腹部周期性灼烧痛为特征，通常发生在胃黏膜表面，具有高发病率、长期持续性和易复发的特点。胃溃疡可能导致严重并发症，包括出血和狭窄形成，这些情况不仅会显著加重疾病严重程度，还可能危及生命或导致长期健康问题。由于反复的愈合和复发，胃溃疡患者的溃疡部位最终可能发展成胃癌（Collatuzzo等人，2022）。胃溃疡现已被公认为一种癌前病变，对公共卫生构成挑战，并显著降低患者的生活质量。世界卫生组织（WHO）已将此病正式列为人类的关键癌前病变。其发病与多种因素有关，如幽门螺杆菌感染、胃黏膜血流减少、不健康的饮食习惯、长期使用非甾体抗炎药（NSAIDs）和过量饮酒（Mani & Natesan，2018；Pichichero等人，2011；Tytgat，2011；Yang等人，2017）。城市化进程加快和生活方式的快速变化导致胃溃疡发病率逐年上升。

传统的胃溃疡治疗策略主要依赖于针对特定病理步骤的单靶点药物，包括质子泵抑制剂（PPIs）、抗酸药和组胺H?受体拮抗剂（Lakshmi等人，2010）。对于慢性胃溃疡，一线治疗方法主要是以PPIs为中心的联合用药方案（Fujimoto等人，2018；Kim等人，2019；Puig等人，2016）。越来越多的临床证据表明，长期使用PPIs与多种不良反应相关，包括癌症风险增加、小肠损伤加重、急性间质性肾炎、低镁血症、骨折、艰难梭菌感染、痴呆、心血管并发症和肾功能衰竭（Abrahami等人，2022；Cheung等人，2018；Gomm等人，2016；Kim，2021；Lazarus等人，2016；Niikura等人，2018；Rameau等人，2021；Shah等人，2015）。

甘草作为一种传统草药，几个世纪以来一直被用于调节胃肠道功能。此外，由于其天然的甜味特性，它还被广泛用作食品和药品中的甜味剂（Shakeri等人，2018）。异甘草素是从甘草根中分离出的主要生物活性黄酮化合物，具有典型的查尔酮结构（Lan等人，2024；Peng等人，2015）。ISL具有多种药理作用，包括抗炎效果和抑制炎症细胞因子表达的能力（Peng等人，2015）。先前的研究已证明ISL在小鼠模型中具有胃保护作用，并阐明了其药代动力学特性、体内组织分布模式和代谢途径（Choi等人，2015）。进一步的研究表明，ISL能够抑制胃癌生长（Yu等人，2023）、调节肿瘤微环境并抑制肿瘤进展（Lee等人，2022）。ISL还被证明能调节细胞和动物模型中的胃肠道运动。这些发现突显了ISL在治疗胃肠道疾病方面的巨大潜力。

本研究在细胞系统和大鼠模型中成功建立了胃溃疡模型，并使用多种分析方法评估了ISL的治疗效果。例如，通过组织病理学染色观察大鼠胃组织形态，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量分析体内各种因素。对预处理ISL的大鼠进行转录组分析以评估其抑制胃溃疡的作用，RT-qPCR验证了转录组数据的可靠性。我们的发现表明，ISL通过抑制TNF信号通路来减轻炎症。体内和体外的Western blot及免疫组化分析证实了这种抑制作用，显示TNF通路中的关键蛋白下调。分子对接、分子动力学模拟和生物层干涉测量法（BLI）共同确定IL-6是TNF通路中的关键靶点。结果表明，ISL通过阻断TNF信号通路来减轻炎症，提示ISL作为膳食补充剂可能是管理胃溃疡相关症状的替代策略。

**2. 材料与方法**
2.1. 试剂
ISL和奥美拉唑购自成都Dest生物技术有限公司。实验中使用的ELISA试剂盒包括：大鼠TNF-α（目录号ZC-37624）、大鼠IL-1β（目录号ZC-36391）、大鼠IL-6（目录号ZC-36404）、人TNF-α（目录号ZC-35733）、人IL-1β（目录号ZC-36391）和人IL-6（目录号ZC-32446）。所有试剂盒均来自上海ZCIBIO科技有限公司。重组人TNF-α（目录号10602-HNAE）和IL-6（目录号UAC051502）分别购自Sino Biological Inc.和南京U-ACT生物技术有限公司。

2.2. 动物实验
2.2.1. 动物分组和给药
体重为180±20克的Sprague-Dawley雄性大鼠由北京华福康生物技术有限公司提供，该公司持有本研究的实验动物生产许可证（SCXK (Jing) 2024–0003）。所有大鼠在无特定病原体（SPF）环境中饲养，环境参数控制为：室温22±2°C，相对湿度50±10%，12小时光照-黑暗周期，提供标准饮食和饮用水。贵州医科大学的机构动物伦理委员会批准了这项研究（批准编号2304499）。实验开始前，所有大鼠进行了7天的适应期。随后，它们被随机分为六组（每组6只）：（1）对照组；（2）模型组；（3）阳性对照组（接受20 mg/kg奥美拉唑，参考Wu等人，2024）；（4–6）模型组+ ISL（低剂量10 mg/kg、中等剂量20 mg/kg和高剂量40 mg/kg）。奥美拉唑和异甘草素均悬浮在0.5% CMC-Na（羧甲基纤维素钠）溶液中，给药前立即涡旋混合以确保均匀性。对照组和模型组均给予等体积的0.5% CMC-Na溶剂。所有给药每天进行一次，持续七天。

第6天给药后，大鼠禁食24小时，期间禁水12小时。实验第7天，除对照组外，其余5组大鼠在给药后1小时经胃内给予75%乙醇溶液（10 mL/kg），而对照组给予等体积的生理盐水（10 mL/kg）。最后一次给药后1小时，通过腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠处死大鼠。处死后采集血液样本并切除胃组织样本进行后续分析。

完全解剖后，沿胃的大曲率方向纵向切开胃组织。为保持组织完整性，用预冷的生理盐水轻轻冲洗胃腔以清除残留物和血块。根据既定标准评估胃黏膜损伤，并使用特定公式计算溃疡指数（UI）：
**UI = 1×A + 2×B + 3×C**
其中A表示≤1 mm的溃疡点，B表示1≤3 mm的溃疡，C表示≥3 mm的线性溃疡。

溃疡抑制率计算如下（Wu等人，2018）：
**抑制率% = (UI_model ? UI_drug) / UI_model × 100%**
UI_model表示模型组的溃疡指数，UI_drug表示给药组的溃疡指数。

2.2.2. 组织病理学分析
胃组织经福尔马林固定后进行处理。使用自动组织处理器脱水，然后包埋于石蜡中并切片。切片经过脱蜡、苏木精染色、脱水和透明处理，最后装片。使用切片扫描系统（型号SQS-600P，深圳胜强科技有限公司）对染色切片进行详细观察。

2.2.3. 周期酸-希夫（PAS）染色
按照上述脱水、包埋、切片和脱蜡步骤，切片用周期酸氧化，随后与希夫试剂孵育并用苏木精溶液复染。染色完成后，切片经过标准脱水和透明处理，最后永久装片。所有组织均使用全自动切片扫描系统（型号SQS-600P，深圳胜强科技有限公司）进行高分辨率数字扫描。图像分析系统用于量化图像中的阳性染色区域。

2.2.4. TUNEL染色
按照上述脱水、包埋和切片步骤，组织样本用柠檬酸缓冲液微波加热进行抗原回收。为了检测细胞凋亡，组织切片用荧光TUNEL试剂处理，并在避光条件下37°C下孵育1小时。复染细胞核后装片。最后，使用VS200数字切片扫描仪（OLYMPUS）对染色组织切片进行扫描和成像。

2.2.5. ELISA测定
全血样本在室温下静置2小时凝固，然后离心（1000 ×g，20分钟）分离血清。随后定量血清中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.3. 细胞药效学评估
2.3.1. 细胞培养
GES-1细胞（人胃黏膜上皮细胞系，目录号ZQ0905）购自上海中桥新洲生物技术有限公司。细胞在37°C、5% CO?湿润环境中培养至80–90%汇合度后用于实验。

2.3.2. 细胞活力测定
使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂检测GES-1细胞的活力。细胞接种到96孔板中（每孔8×103个细胞），培养24小时后进行处理。用2.5、5、10和40 μM浓度的ISL处理细胞24小时后，测量吸光度以评估细胞活力。细胞存活率计算公式如下（Zhao等人，2022）：
**细胞存活率% = (OD_treated ? OD_blank) / (OD_control ? OD_blank) × 100%**

2.3.3. 伤口愈合测定
细胞以5×10?个细胞/孔的密度接种到6孔板中，在标准条件（37°C，5% CO?）下培养24小时。细胞达到90–100%汇合度后进行实验。用无菌200 μL移液器尖端在孔底划线形成直线伤口。冲洗孔洞以去除脱落细胞，然后进行以下实验设计：对照组、模型组以及分别用高剂量（20 μM）、中等剂量（10 μM）或低剂量（5 μM）ISL和奥美拉唑（0.4 μM）处理的组。培养24小时后，模型组、ISL组和奥美拉唑组用1 M乙醇处理4小时以诱导损伤，随后给予相应药物（Wu等人，2024）。对照组不接受乙醇处理或药物处理。再培养24小时后，使用倒置显微镜（Primovert，ZEISS Technology (Suzhou) Co., Ltd.）观察伤口，并用ImageJ软件计算伤口闭合百分比：
**伤口闭合率% = (At_0h ? At_24h) / At_0h × 100%** Hoechst 33342染色：种子细胞以每15毫米培养皿4×10^5个细胞的密度接种，之后培养24小时。吸除培养基后，细胞单层用PBS清洗两次。每个培养皿用1毫升Hoechst 33342染色溶液处理，该溶液在PBS中稀释100倍。经过25分钟的孵育后，细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗三次，然后使用Nikon TS100激光扫描共聚焦显微镜进行核形态评估。

2.3.5 ELISA检测：GES-1细胞以每孔4×10^5个细胞的密度接种到6孔培养皿中，然后孵育24小时，再进行实验干预。在药物处理24小时后，定量上清液/细胞裂解液中的TNF-α、IL-6和IL-1β浓度。

2.4 胃组织转录组学：
2.4.1 样品处理和测序流程：从胃组织中提取RNA时，按照Magen（中国）提供的TRIzol?试剂说明书进行操作。使用Nanodrop ND-2000仪器（Thermo Scientific，美国）通过A260/A280吸光度比值光谱法评估RNA制备物的纯度。使用Agilent bioanalyzer（Agilent Technologies，美国）测定RNA完整性数（RIN）。仅对符合质量控制标准的RNA样本进行文库构建。文库构建按照ABclonal mRNA-seq Lib Prep Kit（ABclonal，中国）提供的协议进行。为了评估最终文库的质量，我们使用了Agilent Bioanalyzer 4150系统。配对末端测序数据在Illumina Novaseq 6000或MGISEQ-T7系统上生成。

2.4.2 数据处理和分析：为了识别表达显著变化的基因，对实验组进行了比较分析。统计显著性定义为绝对log2倍数变化大于1且Padj < 0.05（调整后的P值）。符合这两个标准的转录本被分类为差异表达基因（DEGs）。使用DAVID在线注释工具对GO类别和KEGG通路进行富集分析以解释基因功能。基于STRING数据库检索的数据生成蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。然后使用Cytoscape软件（版本3.7.2）可视化该网络。

2.4.3 蛋白质-蛋白质相互作用分析：将目标通路相关基因列表导入STRING数据库以生成PPI网络。随后使用Cytoscape（版本3.7.1）对网络进行拓扑分析。根据节点的Degree值对基因进行排序，Degree值越高表示在相互作用网络中连接越紧密。

2.4.4 RT-qPCR：从对照组（Con）、模型组（Mod）和高剂量ISL-H组的大鼠中收集胃组织进行RT-qPCR分析。使用FreeZol试剂提取样本中的RNA。从样本中提取并纯化总RNA，然后通过逆转录合成互补DNA（cDNA）。本研究采用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）技术，使用Biomed Green qPCR MasterMix在Bio-Rad CFX96仪器上进行。本研究中使用的所有引物序列见补充表S2。

2.5 通路验证：
2.5.1 西部印迹（Western blot）：我们通过Western blot验证通过KEGG富集分析识别的通路和目标。在冰上使用RIPA裂解缓冲液从GES-1细胞系和胃组织样本中提取蛋白质。离心后，小心收集上清液，用于测定蛋白质浓度。该过程包括电泳、转移、封闭以及与一抗和二抗的孵育。在本实验中检测了目标蛋白质。通过应用增强化学发光（ECL）底物实现可视化。使用ImageJ软件（版本1.54）分析和量化结果图像。

2.5.2 免疫组化（IHC）：胃组织切片的IHC程序包括脱蜡、复水、抗原回收和内源性过氧化物酶活性的淬灭。样品在4°C环境下过夜暴露于针对TNF-α（Cat# AF7014，Affinity；1:100）和IL-6（Cat# GB11117，Servicebio；1:100）的一抗中。第二天，样品与二抗孵育。最后进行核染色。

2.6 关键目标的识别和验证：
2.6.1 分子对接：为了阐明ISL和IL-6之间的结合模式，我们基于PPI预测结果进行了分子对接分析。下载了白细胞介素-6（IL-6）的晶体结构用于本研究。该特定构象对应于Protein Data Bank条目1ALU，从UniProt知识库中获取。对初始结构进行预处理以去除水分子、添加氢原子并优化电荷分布。从PubChem数据库条目中获取isoliquiritigenin（ISL）的化学结构（2D）。使用Chem3D软件对结构进行能量最小化，以获得稳定的三维构象，然后用于分子对接分析。

2.6.2 生物层干涉测量法（BLI）：在BLI测定中，使用Octet平台上的Super Streptavidin（SSA）生物传感器固定目标蛋白质。首先将ISL制备成1×10^5 μM的储备溶液。然后将该储备溶液用磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行一系列梯度稀释。使用Octet系统监测固定蛋白质与药物溶液之间的实时结合相互作用。

2.6.3 分子动力学模拟：基于最低结合能量和与目标蛋白质的有利相互作用模式，选择最优构象。然后使用GROMACS软件（版本2023.1）构建模拟系统，对小分子应用GAFF力场，对蛋白质应用AMBER99SB-ILDN力场。蛋白质-配体复合物在TIP3P水盒中溶解，进行后续分子动力学模拟。

2.6.4 小干扰RNA（siRNA）介导的基因沉默：上海GenePharma Pharmaceutical Technology Co., Ltd.提供了四种IL-6 siRNA序列。GES-1细胞在6孔培养皿中以每毫升1-2×10^5个细胞的浓度接种并培养至60%-80%汇合。使用GP-transfect-Mate转染试剂转染四种IL-6 siRNA和随机阴性对照siRNA。通过Western blot确定表现出最低抑制效率的序列。在识别出抑制效率最低的siRNA序列后，进行Western blot分析以评估相关目标蛋白的表达水平。本研究中使用的所有siRNA寡核苷酸均由上海GenePharma Pharmaceutical Technology Co., Ltd.定制合成。有关特定siRNA序列的详细信息见补充表S3。

2.7 数据分析：连续变量的数据以平均值及其对应的标准差（SD）表示。本研究中的所有定量测量均采用此格式。使用GraphPad Prism软件（版本8.0）进行所有统计分析。使用Student's t检验比较两组之间的差异，使用单因素ANOVA比较多组之间的差异。定义统计显著性的阈值为p < 0.05。所有测试均采用双尾方法进行。

3. 结果：
3.1 体内药效学效应：
3.1.1 ISL缓解大鼠乙醇诱导的胃溃疡：与处理组相比，对照组动物的胃黏膜保存良好，没有明显的病理改变。相反，模型组表现出明显的水肿、充血和深红色变色。ISL-L、ISL-M和ISL-H组显示出剂量依赖性的胃黏膜损伤缓解。奥美拉唑的给药显著减轻了乙醇暴露引起的胃黏膜损伤。这种出血性损伤在治疗后显著减少（图1A）。通过评估两个关键参数验证了大鼠胃溃疡（GU）模型的成功诱导：溃疡指数（UI）及其相应的抑制率（图1B）。

3.1.2 ISL降低大鼠乙醇诱导的胃溃疡中的TNF-α、IL-6和IL-1β表达：收集大鼠的胃组织样本进行细胞因子分析。使用ELISA（图2C）定量这些样本中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平。模型组的炎症因子水平明显高于正常组，表明建立了明显的炎症状态。相比之下，奥美拉唑或ISL（高、中、低剂量）的治疗降低了TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，表明ISL减少了溃疡大鼠胃组织中的炎症因子表达，从而提供了胃保护。

3.2 体外药效学：
3.2.1 ISL减轻GES-1细胞中的乙醇诱导损伤：首先确定ISL的有效浓度。当ISL浓度达到40 μM时，GES-1细胞的存活率受到抑制。在2.5–20 μM的浓度范围内，特别是2.5、5、10和20 μM时，细胞的存活率高于对照组。因此，将ISL分为低剂量（5 μM）、中剂量（10 μM）和高剂量（20 μM）组进行后续实验（图3B）。

3.2.2 ISL减轻大鼠乙醇诱导的胃溃疡中的TNF-α、IL-6和IL-1β表达：收集大鼠的胃组织样本进行细胞因子分析。使用Western blot确定表现出最低抑制效率的siRNA序列。这些结果表明，ISL可以促进GES-1细胞的迁移能力。Hoechst 33342染色结果（图3E）显示，模型组中的细胞核显示出强烈的亮蓝色荧光，表明细胞发生了活跃的凋亡。与模型组相比，奥美拉唑和isoliquiritigenin（ISL）处理显著降低了蓝色荧光强度。这一结果证明了ISL对GES-1细胞凋亡的抑制作用。

3.2.2 ISL降低了GES-1细胞中的TNF-α、IL-6和IL-1β表达
如图3G所示，模型（Mod）组中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著高于对照组。然而，奥美拉唑或ISL处理显著逆转了这些变化。奥美拉唑组和中高剂量ISL组的IL-1β水平均显著低于模型组。奥美拉唑组和所有ISL处理组（高、中、低剂量）的TNF-α和IL-6浓度也显著降低。这些水平与模型组相比明显降低。本研究的结果表明，ISL对炎症过程具有调节作用。这是通过降低GES-1细胞中关键促炎细胞因子的水平来实现的。

3.3 胃组织转录组学中的差异基因表达和富集分析
在此分析中筛选了差异表达基因（DEGs）。选择标准包括绝对log2倍数变化大于1且调整后的P值（Padj）低于0.05。共鉴定出470个逆转的DEGs（表S1）。与正常对照组相比，模型组有497个上调基因。其中，281个在ISL处理后逆转。相反，模型组中有283个基因下调，其中189个在ISL处理后逆转（图4A）。

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图4. ISL治疗大鼠乙醇诱导的胃溃疡涉及的信号通路的综合转录组学筛查。(A) 文氏图。(B) GO功能富集分析。(C) KEGG通路富集分析。(D) TNF信号通路的PPI网络分析。
基于DAVID数据库，这470个差异基因随后进行了基因本体论（GO）富集分析（图4B）。功能注释涵盖了三个GO领域：生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。分析表明，鉴定出的差异基因主要富集在关键生物过程中，包括炎症反应、对肿瘤坏死因子（TNF）的细胞反应以及细胞因子刺激的反应。在细胞组分方面，观察到细胞外空间、细胞外基质、神经元细胞体和细胞膜以及细胞外区域的显著富集。在分子功能方面，这些基因与趋化因子活性和与CXCR趋化因子受体的结合显著相关。

为了探索调控通路，我们对这470个逆转的差异表达基因进行了KEGG富集分析（图4C）。本研究的结果表明，isoliquiritigenin（ISL）对乙醇诱导的胃溃疡具有保护作用。这些有益效果至少部分是通过TNF信号通路介导的。通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）研究分析TNF信号通路（图4D）发现，IL-6的度值最高，其次是Cxcl1、CCL2、SOCS3、FOS和MAP3K8。与转录组学结果一致，RT-qPCR结果（图4E）表明，低剂量ISL处理有效逆转了这些关键基因的表达趋势。这一实验验证进一步证实了转录组数据的可靠性和生物学相关性。

3.4 ISL抑制TNF信号通路并改善乙醇诱导的胃溃疡
转录组富集分析表明，ISL对乙醇诱导的胃溃疡的治疗作用主要是通过TNF信号通路实现的。这一发现通过补充实验方法得到了证实。具体来说，通过体外细胞系统和体内动物研究进行了验证。

为了评估TNF通路中的关键组分，我们对体外样本进行了Western blotting分析。分析的目标包括配体（例如TNF-α、IL-6）、上游适配器（TNFR1、TRADD）以及磷酸化的下游效应器如NF-κB和MAPK。我们的分析表明，模型（Mod）组的GES-1细胞中多种TNF通路组分的水平显著升高。这些包括TNF-α、IL-6、TNFR1以及磷酸化的NF-κB和MAPK。相反，高剂量ISL（ISL-H组）处理有效地抵消了这些变化（图5A-C）。

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图5. ISL通过抑制TNF信号通路减轻GES-1细胞中的乙醇诱导损伤。(A) GES-1细胞中p-p65、p65、TNFR1和TNF-α的表达水平（n = 3）。(B) GES-1细胞中IL-6和TRADD的表达水平（n = 3）。(C) GES-1细胞中p-p38和p38的表达水平（n = 3）。*p < 0.05，**p < 0.01与对照组相比；#p < 0.05，##p < 0.01与模型组相比。
在体内，通过Western blot和免疫组化进一步验证了TNF通路的参与。Western blot分析显示，模型组胃组织中的TNF-α、IL-6、TNFR1、TRADD、p-NF-κB和p-MAPK的蛋白水平显著升高。ISLH处理后，这些升高的水平显著降低（图6A-B）。免疫组化分析表明，模型组大鼠胃组织标本中的TNF-α和IL-6表达显著升高。与空白对照组相比，这种增加更为明显。相反，ISL处理显著降低了这两种细胞因子的阳性免疫染色（图7）。

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图6. ISL通过抑制TNF通路改善大鼠乙醇诱导的胃组织损伤。(A) 大鼠胃组织中TNFR1、TRADD、TNF-α和IL-6的蛋白表达水平（n = 6）。(B) 大鼠胃组织中p-p65、p65、p-p38和p-38的蛋白表达水平（n = 6）。*p < 0.05，**p < 0.01与对照组相比；#p < 0.05，##p < 0.01与模型组相比。

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图7. 大鼠胃组织中TNF-α和IL-6表达的免疫组化分析。(A) TNF-α和IL-6染色的代表性免疫组化图像（400×）。(B) TNF-α阳性染色区域的相应定量（平均值±SEM，n = 3）。*p < 0.05与对照组相比；#p < 0.05与模型组相比。(C) IL-6阳性染色区域的相应定量（平均值±SEM，n = 3）。*p < 0.05，**p < 0.01与对照组相比；#p < 0.05，##p < 0.01与模型组相比。

3.5 关键靶点的鉴定和验证
通过TNF信号通路内PPI网络的度值分析，IL-6被确定为关键调控靶点。进行了IL-6和ISL之间的分子对接（图8A）。ISL和IL-6之间的结合能低于-5 kcal/mol，显示出强烈的亲和力。

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图8. TNF信号通路中关键靶点的鉴定和验证。(A) ISL与IL-6的分子对接。(B) ISL与IL-6结合的生物层干涉测量（BLI）分析。(C) ISL-IL-6复合物的分子动力学模拟。(D) IL-6 siRNA序列的筛选（n = 3）。*p < 0.05，**p < 0.01与NC组相比。(E) siRNA敲低IL-6后TNF通路中其他靶点的蛋白表达水平（n = 3）。*p < 0.05，**p < 0.01与NC组相比；#p < 0.05，##p < 0.01与NC ± EtOH(1 M)组相比。
BLI结果（图8B）显示ISL和IL-6之间结合的响应值随浓度增加而增加。确定了ISL-IL-6相互作用的解离常数（Kd），表明具有高结合亲和力。分子动力学模拟结果（图8C）显示IL-6/ISL复合物保持了结构稳定性，RMSD值在0.2到0.6 nm之间。此外，回转半径（Rg）值保持相对较低且稳定，表明复合物的构象紧凑。均方根波动（RMSF）分析表明活性位点附近的残基波动最小。最后，使用siRNA敲低了GES-1细胞中的IL-6表达。Western blot分析表明，siRNA-3转染显著降低了IL-6的表达，达到测试序列中的最低表达水平（图8D）。用si-IL-6或其阴性对照（NC）转染的GES-1细胞在有无ISLH的情况下接受了乙醇（1 M）处理。随后，使用Western blot分析测量了IL-6、TNFR1、TRADD和TNF-α的蛋白表达水平（图8E）。在NC转染的细胞中，乙醇显著上调了这些蛋白的表达，而ISLH逆转了这一效应。在si-IL-6转染的细胞中，乙醇未能诱导这些蛋白的上调，ISL-H也没有进一步的抑制作用。这些发现表明IL-6在TNF信号级联中起关键作用，在改善乙醇诱导的胃溃疡中发挥核心作用。

4. 讨论
胃溃疡是一种常见的胃肠道疾病，指的是穿过胃黏膜层并延伸到胃壁黏膜下层的局部缺陷。过量饮酒是导致胃溃疡的常见因素。由于其明确的特性，乙醇诱导的胃溃疡模型在药理学研究中被广泛使用。该模型一致地在胃组织中引起充血和水肿，并伴有促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平的显著升高（Guo等人，2024；Liang等人，2025；Meng等人，2024；Wu等人，2024）。大量证据表明胃溃疡（GU）与炎症之间存在强烈相关性，表明抑制炎症反应是治疗GU的可行策略（Ermis等人，2023；Gündo?du等人，2024；Mahmoud & Abd El-Ghffar，2019）。传统的质子泵抑制剂常用于胃溃疡的临床管理。然而，它们相关的不良反应限制了其治疗应用。ISL是一种天然存在的黄酮类化合物，来源于植物。这种化合物具有多种有益的生物特性，如抗氧化、抗炎和抗癌活性。多项研究强调了ISL的巨大药用潜力，显示出其对胃疾病的显著治疗效果（Chen等人，2009；Choi等人，2015；Lee等人，2022；Yu等人，2023）。isoliquiritigenin（ISL）治疗胃溃疡的核心治疗靶点和分子机制尚未完全了解，其通过抑制炎症反应治疗胃溃疡的潜力也未被报道。

胃溃疡的进展与炎症密切相关。有效抑制炎症反应是溃疡愈合的先决条件。在临床实践中，无论采用何种治疗方法，最终目标都是减轻炎症对胃黏膜的损害。只有通过控制炎症反应并减少炎症因子对胃黏膜细胞的刺激，才能从根本上治愈胃溃疡。由酒精等因素引发的持续炎症反应值得注意，因为它既能损害胃黏膜，又能促进炎症细胞的浸润，并侵蚀黏膜的腺体结构，从而推动慢性萎缩性胃炎（CAG）的发展（Liu等人，2023；Zhou等人，2026）。

慢性萎缩性胃炎在病理学上定义为特化胃腺体的丧失。这种情况通常伴有肠化生和异型增生，使其成为胃癌的公认前兆病变（Yin等人，2022）。不同程度的胃黏膜萎缩是胃溃疡患者的常见临床发现，反映了共同的炎症发病机制。常见的风险因素包括幽门螺杆菌感染、饮酒和胆汁反流，这些因素推动了这两种情况的发展和进展（Li等人，2024；Wang等人，2023）。因此，阐明炎症介质如何协调胃溃疡和慢性萎缩性胃炎的发生机制对于打破炎症-萎缩-癌变序列至关重要。

自20世纪70年代以来，TNF已被认为是许多炎症过程中的核心介质，包括细胞存活、凋亡和坏死（Brenner等人，2015）。白细胞介素-1β（IL-1β）可以诱导趋化因子的产生，从而促进免疫细胞的浸润（Melton & Qiu，2020）。白细胞介素-6（IL-6）是一种关键的细胞因子，它协调促炎反应并促进免疫细胞的浸润。据报道，循环中IL-6浓度的降低与抗炎状态相关，而IL-6水平的升高则促进向促炎状态的转变（Hu等人，2022）。在本研究中，IL-6表现出促炎效应。乙醇刺激后，模型组大鼠显示出显著的胃出血和明显的溃疡指数增加。宏观和微观评估表明，不同剂量的ISL显著改善了乙醇诱导的胃溃疡，表现为溃疡指数降低和溃疡抑制率提高，且这种效果具有剂量依赖性。乙醇暴露导致GES-1细胞收缩和凋亡增加。促炎细胞因子（特别是TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达水平在模型组中升高。ISL的给药显著降低了这些细胞因子的水平。体内和体外的药效学研究结果表明，ISL显著减轻了乙醇诱导的胃溃疡的炎症。通过对大鼠胃组织的转录组分析，发现了281个差异表达基因（DEGs），这些基因在模型组（Mod）中上调，在ISL-H组中相对于模型组下调。此外，还有189个DEGs是在模型组中下调而在ISL-H组中上调的基因的交集中获得的。总共通过转录组分析筛选出了470个DEGs。通过对这些基因进行GO富集的功能注释，发现这些基因与特定的生物过程密切相关，尤其是炎症反应和TNF介导的细胞反应。在分子功能（MF）类别中，与趋化因子相关的过程显示出显著的富集。趋化因子作为信号分子，协调免疫细胞进出组织，并指导细胞间的相互作用。它们对免疫细胞的产生和招募至关重要，显著影响肿瘤微环境（Ozga等人，2021年）。根据表达模式和功能作用，趋化因子可分为炎症型和稳态型。稳态型趋化因子在正常生理条件下持续表达，促进细胞迁移和归巢；而炎症型趋化因子在炎症部位迅速释放，吸引效应细胞聚集（M?rkl等人，2022年）。研究表明，趋化因子的表达失衡可能导致不适当的免疫反应，从而引起组织损伤或恶性肿瘤（Jafarzadeh等人，2019年）。本研究中，通过RT-qPCR验证了从转录组结果中鉴定出的趋化因子CXCL1和CCL2，发现胃溃疡的诱导导致它们的表达上调。ISL治疗成功恢复了这些趋化因子的升高表达水平。KEGG分析显示，差异表达基因最显著的富集发生在TNF信号通路中。TNF-α通过其两个特异性受体TNFR1和TNFR2介导炎症信号传导，这两个受体启动不同的下游级联反应。虽然TNFR2主要在特定类型的细胞上表达，但TNFR1几乎存在于所有有核细胞中。TNFR1含有死亡结构域，参与多种细胞过程，包括细胞死亡信号传导、炎症、细胞存活和增殖（Tiegs & Horst，2022年）。TNF-α主要与TNFR1结合，导致TRADD的招募和复合物I的组装。随后，该复合物刺激NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路（Preedy等人，2024年），从而上调关键炎症介质（包括IL-6、TNF-α和IL-1β）的合成。在TNF通路的下游信号传导中，NF-κB在激活后发生磷酸化。随后，IκB蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解，解除其对NF-κB的抑制作用，促进其向核内的转位。NF-κB转位到细胞核并与基因启动子结合，从而调节关键促炎介质（包括TNF-α和IL-6）的转录。这一信号事件最终放大了炎症级联反应（Lawrence，2009年）。TNF-α和IL-6通过磷酸化p38激活MAPK通路，进而促进细胞死亡。本研究分析了GU组的GES-1细胞，这些细胞显示出TNF-α、IL-6、TNFR1、TRADD、p-p38和p-p65的蛋白质表达显著增加。ISL治疗降低了TNF-α、IL-6、TNFR1和TRADD的水平，并抑制了p38和p65的磷酸化。ISL的抗炎作用源于其对TNF信号通路的抑制，从而减少了炎症因子的表达并阻断了下游的磷酸化信号传导。目标分子与小分子之间结合亲和力的验证使得药物候选物的筛选更加精确。生物物理技术、生化方法和其他创新技术的出现为药物靶点鉴定提供了新的方法。分子对接技术通过计算模拟小分子与生物大分子之间的结合模式和亲和力，加速了大规模化合物库的筛选（Bai等人，2023年）。分子动力学模拟通过建模生物系统内原子运动的轨迹，阐明了生物分子在不同时间尺度上的构象变化和动态过程（Bai等人，2023年）。生物层干涉测量（BLI）是一种光学技术，通过观察生物传感器尖端的实时干涉模式变化来分析无标记的分子相互作用（Jung等人，2022年）。本研究调查了TNF信号通路中的关键靶点。通过对11个通路富集靶点的PPI分析，发现IL-6是影响最大的节点，表明其作为关键调控靶点的潜力。随后，通过分子对接、分子动力学（MD）模拟和生物层干涉测量（BLI）综合评估了ISL与IL-6之间的结合。对接分析显示该化合物形成了一个稳定的复合物，其结合能为?5 kcal/mol。MD模拟显示复合物的RMSD和Rg值处于合理范围内，表明其结构紧凑且稳定。BLI分析显示ISL-IL-6结合的响应值随浓度增加而增加，解离常数（Kd）较低，证实了其强结合亲和力。这些发现强调了IL-6在TNF信号通路中的关键作用。小干扰RNA（siRNA）是一种短双链RNA，通过介导RNA干扰来诱导目标信使RNA（mRNA）的序列特异性降解（Alshaer等人，2021年）。它广泛应用于功能基因组学研究、药物靶点验证和治疗应用。此外，研究表明IL-6的持续分泌会放大炎症反应（Singh等人，2023年），从而加剧炎症。因此，各种动物疾病模型采用IL-6敲除或阻断策略来预防和治疗疾病（Katsume等人，2002年；Tanaka等人，2014年）。为了确认IL-6在细胞炎症中的关键作用，我们使用siRNA技术特异性降低了其表达，导致GES-1细胞内内源性IL-6显著减少。进一步分析表明，IL-6下调减少了TNF通路中关键成分（如TNF-α、TNFR1和TRADD）的表达。综合PPI分析、分子对接、分子动力学模拟、BLI和siRNA实验的结果，我们确定IL-6是TNF信号通路中的关键靶点。尽管本研究初步表明ISL通过调节TNF信号级联反应来缓解胃黏膜损伤，但必须认识到胃溃疡发病机制的复杂性。疾病过程涉及多种细胞群体、时空动态和微环境相互作用，这些无法通过传统方法完全捕捉。包括类器官模型在内的先进方法代表了未来研究中可用于更精确揭示潜在机制的强大工具。特别有前景的技术是单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学。类器官是在受控培养条件下从胃干细胞衍生出的三维自组织微型结构（Liu等人，2024年）。来自人类组织样本的胃类器官具有独特的属性组合，使其在生物医学研究中非常吸引人。它们能够紧密再现天然胃的特征，结合易于基因操作和在培养中的持续增殖潜力，使得这些三维模型能够忠实复制胃黏膜的解剖和生理特性。因此，它们已成为疾病建模、药物筛选和再生医学研究的多功能工具（Hong等人，2025年；Idowu等人，2022年）。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq），研究人员可以在单细胞分辨率下进行转录组分析，从而揭示传统批量RNA测序方法无法检测到的异质性（Mahat等人，2024年）。Hou等人利用这种方法阐明了吲哚美辛诱导的小鼠模型中的胃损伤分子机制（Hou等人，2025年）。单细胞转录组分析进一步表征了原发性胃癌和器官特异性转移瘤的异质性微环境，推动了精准诊断和靶向治疗的发展（Jiang等人，2022年）。未来scRNA-seq的应用有望在单细胞分辨率下解析ISL的精确细胞靶点及其伴随的转录重编程事件。这种高分辨率的探究将有助于更深入地理解ISL的治疗效果背后的多靶点机制。通过将空间信息与转录组分析相结合，空间转录组学能够在保持原始结构的同时，检查原生组织中的基因表达模式。Dong等人利用这种方法结合单细胞测序，全面表征了人类胃上皮的细胞异质性和稳态机制（Dong等人，2023年）。空间转录组学在胃癌研究中越来越被用于解析肿瘤微环境和阐明疾病进展机制（Cousin等人，2024年；Huang等人，2023年；Lee等人，2025年）。未来将这项技术与单细胞测序相结合，将能够可视化ISL在溃疡胃组织中的炎症信号级联抑制作用。特别值得关注的是TNF/NF-κB信号轴，这是一个关键的促炎通路。此外，它还可以揭示ISL如何重塑参与黏膜屏障修复的基因的空间表达模式，为其在受损区域中的靶向治疗作用提供直接的空间证据。类器官模型、单细胞分辨率下的转录组分析和空间分辨转录组学的整合，将推动胃疾病研究的发展——超越传统分子技术的限制，实现三维空间细节和单细胞精度的分析。本研究初步阐明了ISL对抗胃溃疡的治疗效果和机制，尽管仍存在一些局限性。例如，体内实验并未进一步验证IL-6下调是否会影响TNF通路中的其他靶点。IL-6在TNF通路中的确切功能需要进一步探索。尽管本研究主要关注TNF信号级联反应，但不能排除其他分子通路也可能在ISL对抗胃溃疡的治疗作用中发挥作用。因此，未来的研究将探索ISL介导的GU治疗中涉及的额外潜在信号通路或靶点。此外，尽管本研究使用了乙醇诱导的GU模型——这与临床酒精相关溃疡病例相关——但现实世界中的大多数胃溃疡是慢性的。因此，后续研究将探讨慢性GU的诱导和修复过程。总之，虽然本研究考察了isoliquiritigenin的抗炎特性，但仍需进一步研究其其他药理活性，包括抗癌、抗氧化和神经保护作用（Mustafa等人，2025年）。我们旨在扩展对ISL药理潜力的理解，并为其未来发展提供坚实的实验基础。5. 结论总之，SD大鼠的体内研究和使用GES-1细胞的体外实验均表明，ISL可以缓解炎症反应，抑制胃黏膜细胞凋亡，并对胃溃疡（GU）具有保护作用。更重要的是，本研究通过转录组分析初步阐明了ISL介导的GU治疗涉及的信号通路。ISL通过调节TNF通路来抑制凋亡并维持胃黏膜完整性，从而改善乙醇诱导的GU。计算模拟和分子生物学实验的结合为TNF通路提供了强有力的验证，并确定IL-6是关键靶点。这些发现为ISL作为功能性食品成分以缓解GU和促进胃肠道健康提供了重要证据。伦理声明本研究获得了贵州医科大学机构动物伦理委员会的伦理批准（批准编号：2304499）。CRediT作者贡献声明Yan Li：写作——审稿与编辑、撰写原始草稿、可视化、验证、软件、资源、项目管理、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。Yang Jin：监督、调查、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。Wanfen Shu：方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。Herong Li：验证、软件、资源、项目管理、调查、概念化。Chuang Zhang：可视化、软件、资源、调查、数据管理、概念化。Xiaohuan Wang：软件、资源、方法学、调查。Guokun Zhang：可视化、验证、软件、资源。Xiuyue He：验证、监督、方法学、调查。Ziyu Li：验证、监督、方法学、调查。Min Luo：验证、资源。Wen Liu：监督、方法学、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。