《Microchemical Journal》：Rapid detection of protein content in fungal mycelia using robust NIR spectroscopy framework for precise control of fermentation process
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近红外光谱结合化学计量模型用于快速非破坏性测定发酵真菌菌丝体蛋白含量研究。采用CARS-SPA-PLSR优化模型，在湿度<65%条件下实现R2?=0.9253，RMSEP=3.00%，有效解决传统方法耗时、破坏样本及干扰问题。
范可俊|康定荣|康世鹏|胡光耀|雷朗瑞|李明霞|张伟|穆罕默德·卡姆鲁扎曼|道格拉斯·F·巴宾|苏文豪
中国农业大学工程学院，北京市海淀区清华东路17号，邮编100083
摘要
随着全球对替代蛋白需求的持续增长，高效快速的蛋白质定量方法变得十分迫切。真菌菌丝由于其营养价值和可持续性，成为一种有前景的蛋白质来源。传统的蛋白质测定技术通常劳动强度大、耗时较长，且不适合动态监测。本研究探讨了近红外（NIR）光谱与化学计量建模相结合，在不同发酵条件下快速、无损地预测真菌菌丝中蛋白质含量的潜力。当水分含量低于65.00%时，局部加权偏最小二乘回归（PLSR）模型表现出较高的预测性能，R2?为0.9005，RMSEP为2.07%。为了提高模型的稳健性，应用了竞争性自适应加权采样（CARS）、连续投影算法（SPA）和随机森林（RF）等变量选择方法。优化后的CARS-SPA-PLSR模型仅使用七个特征波长，获得了R2?为0.9253，RMSEP为3.00%，相应的相对均方根误差（RRMSE）为18.3%，绝对相对误差（ARE）为14.6%，表明其具有出色的预测准确性和较低的相对误差。这些结果表明，将NIR光谱与先进的化学计量学方法结合使用，为真菌发酵系统中的快速蛋白质监测提供了一种可靠且实用的方法。
引言
丝状真菌因其在食品生产中的潜力而成为研究焦点[20]。通过发酵，这些真菌会产生富含蛋白质、不含胆固醇、易于消化且低脂肪的替代蛋白来源[41]。在多种丝状真菌中，如黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和黄青霉（Penicillium chrysogenum [26]），其中一些品种因安全性而被广泛用于食品和制药行业的蛋白质生产。
与传统作物不同，真菌可以全年种植，从而提供高效、可持续且稳定的高质量蛋白质供应[33]。在未来的食品生产中，丝状真菌有望替代动物源产品，并开发出营养丰富的基于真菌的饮料，以满足不断变化的饮食偏好[24]。此外，真菌蛋白质生产过程中减少的温室气体排放进一步支持了全球可持续发展目标[1]。
多项研究探索了不同生物样本中蛋白质检测的各种光谱技术。化学发光技术虽然灵敏度高，但需要大量优化工作，包括试剂选择、反应条件及仪器校准，这限制了其应用范围[2]。电泳技术虽然能有效测定分子量和浓度，但会导致蛋白质变性、样品制备复杂且需要大量样本[48]。荧光光谱虽然精确，但容易受到周围分子的干扰，从而影响复杂生物环境中的测量准确性[14]。紫外吸收技术虽然快速，但灵敏度较低，不适合检测低浓度蛋白质。Bradford法虽然比紫外吸收法更灵敏，但容易受到某些化学物质的干扰，影响定量准确性[19]。此外，传统的凯氏定氮法和杜马斯燃烧法基于氮含量来估算蛋白质含量[25]。然而，这些方法存在挑战：凯氏定氮法使用有害化学物质，存在环境和健康风险；杜马斯法虽然速度快，但成本较高且需要将样品研磨成粉末。这些传统方法无法满足对快速、实时检测日益增长的需求，凸显了寻找更合适替代方法的必要性。
近红外（NIR）光谱技术作为一种有前景的技术，能够快速且无损地评估生物样本中的蛋白质含量[6]、[16]。它与含氢基团（如-OH、-NH和-CH）相互作用，这些基团的吸收模式取决于其分子结构[4]、[50]。通过结合化学计量模型，NIR光谱的分析能力得到显著提升，从而可以从复杂的光谱数据中提取有价值的信息[18]、[40]。
最近的研究已在多种场景中成功应用NIR光谱技术，包括检测谷物中的化学成分[13]、食品安全控制[15]以及监测水质和土壤污染等环境参数[30]、[51]。Ni等人[27]探讨了使用NIR光谱和偏最小二乘回归（PLSR）及主成分分析（PCA）等化学计量模型检测昆虫蛋白掺假的问题。然而，他们指出该方法在分辨脂质和几丁质中的C
H键等重叠光谱特征方面存在局限性，这限制了其在复杂基质中的应用。张硕等[51]提出了一种方法，利用多源机器学习算法（如反向传播神经网络（BPNN）、PLSR、极端学习机（ELM）和随机森林回归器（RFR）以及连续小波变换（CWT）等特征选择方法，快速准确地检测小麦蛋白质和湿面筋含量。尽管如此，他们的研究仍表明NIR光谱无法完全捕捉与质量参数相关的细微变化或非线性信息。
NIR光谱在菌丝蛋白检测中的应用仍然有限。因此，本研究旨在通过开发专门针对菌丝蛋白定量设计的优化模型来填补这一空白。本研究重点解决水分干扰问题，这是NIR测量中的一个关键挑战，以确保准确预测水分和蛋白质含量。最终，本研究旨在深入理解菌丝中蛋白质的定量方法，并推动NIR光谱在替代蛋白来源中的应用。本研究的新贡献包括：（1）系统评估NIR光谱在真菌菌丝中快速测定蛋白质的可行性，这是一个尚未充分探索的应用领域；（2）实现湿样本中的实时水分和蛋白质检测；（3）建立一种分析工作流程，结合传统回归技术和变量选择方法，利用湿样本光谱数据预测干样本中的蛋白质含量，从而间接考虑干燥过程中的结构变化；（4）通过改进模型性能，减少水分干扰这一影响NIR测量的重要因素，实现可靠的实时蛋白质评估。
样本制备
为了制备具有不同蛋白质和水分含量的样本，配制了多种成分的培养基，以模拟丝状真菌的不同营养环境。选择Rhizomucor pusillus FF23和Neurospora intermedia FF171作为模型生物，因为它们在蛋白质发酵方面具有工业相关性，并具有独特的代谢特性。
对于Rhizomucor pusillus，培养基的设计旨在促进细胞快速生长和蛋白质生物合成。
菌丝样本的物理化学分析
图1显示了在不同发酵基质中培养的300个菌丝样本的物理化学分析结果。水分含量范围为38.10%至94.50%，蛋白质含量范围为30.70%至68.50%。这些样本根据Kennard-Stone（KS）算法[37]改进的基于联合x–y距离的样本集分割（SPXY）[10]算法被分为校准集（210个样本）和预测集（90个样本）。讨论
从实际应用的角度来看，本研究提出的工作流程能够实现快速、在线监测。从从发酵罐中提取少量样本，将其均质化并压缩成颗粒，获取NIR光谱（通常不到1分钟），到获得模型预测，整个分析过程可以在5到8分钟内完成。这种快速周转时间能够提供关于关键工艺参数（如总生物量蛋白质质量）的近乎实时的反馈。
结论
本研究首次将近红外光谱技术应用于真菌菌丝蛋白质的快速、无损定量分析以及基于蛋白质含量的样本分类。CARS-SPA技术利用CARS识别与蛋白质含量相关的特征波长，并通过SPA有效选择关键变量以进行蛋白质预测。这是NIR光谱技术在原位检测中的首次应用。
作者贡献声明
范可俊：撰写 – 审稿与编辑、撰写初稿、方法论、数据管理。康定荣：可视化、资源准备、实验设计、正式分析、数据管理、概念构建。康世鹏：撰写初稿、可视化、软件开发、资源管理、项目协调、方法论、数据管理、概念构建。胡光耀：方法论、实验设计。雷朗瑞：正式分析、数据管理。李明霞：实验设计、数据管理、概念构建。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金[资助编号：32371991]和中国农业大学2115人才发展计划的支持。
范可俊是中国农业大学工程学院的硕士研究生。她的研究方向包括植物表型分析、高光谱成像、近红外光谱和化学计量学，用于农业和微生物生产系统的智能监测。她发表了多篇SCI索引论文，并参与了与农业智能传感和生物过程优化相关的国家研究项目。她目前的研究兴趣包括……
