《Microchemical Journal》：Design of experiments-based development and validation of RP-HPLC and UV spectroscopic methods for the simultaneous determination of citicoline and nimodipine in pharmaceutical formulations
编辑推荐：
西比灵与尼莫地平的同步分析方法开发及验证，采用设计优化实验（DoE）建立RP-HPLC与UV光谱法，优化缓冲液pH、流速及有机溶剂比例，符合ICH Q2(R1)规范，结果可靠适用于制药质检。
T. Sudha | K. Archana | V.S. Akash Kumar | R. Bharath | J. Amsavalli
印度泰米尔纳德邦金奈Pallavaram市Vels科学、技术和高级研究学院（VISTAS）药学科学学院药学化学与分析系，邮编600117
摘要
采用实验设计（DoE）方法开发并验证了RP-HPLC和UV分光光度法，用于同时测定合成药物制剂中的西尼可乐林（citicoline）和尼莫地平（nimodipine）的含量。UV分光光度分析在甲醇中进行，尼莫地平的检测波长为239 nm，西尼可乐林的检测波长为271 nm。RP-HPLC方法的开发采用了中心复合设计（Central Composite Design），以研究缓冲液pH值、流速和有机溶剂组成对色谱响应的影响。通过Derringer的优度函数（desirability function）对多响应参数进行了优化，考虑了保留时间、容量因子和分辨率等因素。优化后的色谱条件为：甲醇（40%）和磷酸盐缓冲液（60%），pH值为3.8（用正磷酸调节），流速为1.0 mL/min，使用C18色谱柱在225 nm处进行UV检测。西尼可乐林和尼莫地平的保留时间分别为3.007 min和5.741 min，分离效果良好。这两种方法均符合ICH Q2（R1）指南的要求。方差分析（ANOVA）的结果证实了模型参数的显著性以及所开发RP-HPLC方法的可靠性。所提出的方法简单可靠，基于DoE的设计方法提高了方法的理解度和稳健性，适用于药物制剂的常规质量控制分析。
引言
西尼可乐林（图1a），也称为胞苷二磷酸胆碱（CDP-choline），是磷脂生物合成中的关键中间体，尤其是磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine），对神经膜的结构和功能至关重要[1]。磷脂酰胆碱在中枢神经系统中维持细胞完整性方面起着重要作用。西尼可乐林作为胆碱供体，而胆碱是参与记忆、学习和认知过程的神经递质乙酰胆碱（acetylcholine）的前体。除了其作为神经递质的功能外，西尼可乐林还支持神经修复和膜稳定，特别是在缺血和神经退行性疾病条件下[2]。
尼莫地平（图1b）是一种二氢吡啶类钙通道阻滞剂，对脑血管具有高度选择性，主要用于治疗蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）[3]。它通过电压依赖性的L型钙通道抑制钙离子内流，从而扩张脑血管并改善脑血流量。这种靶向药理作用在预防SAH相关的延迟性脑缺血方面特别有效[4]。
高效液相色谱（HPLC）因其高精度、重复性和分离复杂混合物的能力而广泛应用于药物分析。色谱分离效率取决于多种因素，包括流动相组成、缓冲液pH值、色谱柱特性和流速。其中，流动相pH值通过影响分析物的离子化行为，进而影响保留时间、选择性和分辨率[5]。在同时分析结构不同和理化性质不同的化合物（如西尼可乐林和尼莫地平）时，仔细优化这些参数尤为重要。
近年来，分析方法开发越来越多地采用基于“分析质量设计”（Analytical Quality by Design，AQbD）原则的风险导向和系统化框架，以确保方法的稳健性和符合法规要求[6]。该方法整合了预定义的分析目标、风险评估和多变量优化工具，以识别和控制关键方法参数（Critical Method Parameters，CMPs）。实验设计（DoE），特别是中心复合设计（Central Composite Design，CCD）等响应面方法，能够定量评估因子-响应关系并建立可靠的设计空间。最近的分析综述和研究[7]、[8]、[9]指出，DoE在色谱优化中的应用显著提高了方法的理解度和稳健性。
甲醇和乙腈等有机溶剂常用于反相HPLC，它们的比例显著影响分析物的洗脱行为和分离效率[10]。除了溶剂组成外，缓冲液pH值和流速也是必须系统优化的关键变量，以实现稳定的色谱性能。
文献调查显示，已有许多分析方法用于单独或联合测定西尼可乐林。这些方法包括UV分光光度法（如差分光谱法[11]、一阶导数光谱法[12]、校准曲线法[13]），以及色谱和电化学技术（如气相色谱[14]、电位法[15]、人体血浆中的HPLC分析[16]、药代动力学研究[17]、常规HPLC方法[18]和稳定性指示的HILIC方法[19]）。也有报道使用UV吸收校正法[20]、Q-吸光度法[20]、RP-HPLC[21]、UPLC[22]和HPTLC技术[23]同时测定西尼可乐林与其他药物的含量。
同样，也有多种分析方法用于单独或联合测定尼莫地平。这些方法包括UV分光光度法（如校准曲线技术[24]、零阶和导数光谱法[25]、基于溶剂的UV方法[26]、比色分析[27]、带UV检测的HPLC[28]、通过HPLC进行杂质分析[29]、基于QbD的杂质测定[30]、用于人体血浆分析和药代动力学的LC-MS和LC-MS/MS方法[31]、[32]。还有一些研究报道了在存在降解产物的情况下同时测定西尼可乐林和尼莫地平的方法[33]、[34]、[35]。
尽管有这些报道，但关于基于DoE的RP-HPLC方法用于这种药物组合的文献较少，且明确建立设计空间的研究更为有限，使用同时方程法的UV分光光度分析也鲜有探索。此外，目前主要药典中尚无西尼可乐林和尼莫地平的联合专论，这凸显了开发分析上稳健且实际可行的方法的必要性。
因此，本研究旨在开发并验证两种互补的分析方法：一种基于同时方程法的UV分光光度法，以及一种使用QbD指导的中心复合设计优化的RP-HPLC方法。目标是实现西尼可乐林和尼莫地平在合成药物制剂中的可靠、准确和高效的同时测定，特别关注方法的理解度、稳健性和适用于常规质量控制的应用。
设备
仪器
色谱分析使用的是Shimadzu HPLC-2030 Plus Prominence系统，由LabSolutions软件（Shimadzu，日本）控制，配备脱气器和自动采样光电二极管阵列（PDA）检测器。UV光谱测量使用Shimadzu UV-1100系列分光光度计进行。样品超声处理使用Labman Ultra Sonicator完成，标准品和样品的精确称重则使用Mettler-Toledo XPE205分析天平进行。
线性
如图2所示，西尼可乐林和尼莫地林的叠加光谱在各自的波长处显示出明确的吸光峰。在西尼可乐林和尼莫地平的浓度范围内（分别为7–12 μg/mL和2.1–3.6 μg/mL），该方法表现出良好的线性。校准曲线的相关系数（R2 > 0.999），表明两种分析物的吸光度与浓度之间存在极好的线性关系。
检出限（LOD）和定量限（LOQ）
响应标准偏差……（原文此处数据缺失）
与已有方法的比较
如表9所示，所开发的RP-HPLC方法比以往报道的方法具有更高的灵敏度，体现在西尼可乐林和尼莫地平的检出限和定量限更低。这些结果表明，所开发的RP-HPLC方法在保持适用于常规质量控制应用的同时，提供了更高的灵敏度和分析效率。尽管以往的方法具有更宽的线性范围，但本研究开发的方法……（原文此处内容不完整）
结论
本研究主要开发并验证了两种分析方法：（i）使用同时方程法的紫外光谱法；（ii）基于质量设计（Quality by Design，QbD）方法的RP-HPLC，用于同时测定药物制剂中的西尼可乐林和尼莫地平。
这两种方法均严格遵循ICH Q2（R1）指南进行了验证，表现出出色的准确性、精确度和可靠性。紫外光谱法……（原文此处内容不完整）
CRediT作者贡献声明
T. Sudha：项目管理、方法学设计、数据整理、概念构建。
K. Archana：方法验证、软件应用。
V.S. Akash Kumar：初稿撰写、资源协调。
R. Bharath：初稿撰写与修订、软件应用、资源协调。
J. Amsavalli：资源提供、数据分析。
资金
本研究未接受任何外部资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响本文研究的个人关系。
致谢
作者感谢Vels科学、技术和高级研究学院（VISTAS）管理层在研究设施和鼓励方面的支持。
