木霉菌株调节牙痛植物（Acmella spp.）中spilanthol的浓度：一种多变量生物刺激方法

《South African Journal of Botany》：Trichoderma strains modulate spilanthol concentration in the toothache plant ( Acmella spp.): A multivariate biostimulation approach

　　弗朗西斯科·劳里马尔·多·纳西门托·安德拉德（Francisco Laurimar do Nascimento Andrade）、布鲁诺·若泽·布里托·特谢拉（Bruno José Brito Teixeira）、卢卡斯·达·席尔瓦·桑托斯（Lucas da Silva Santos）、拉斐尔·法齐·戈麦斯（Rafaelle Fazzi Gomes）和赫尔韦·路易斯·吉斯兰·罗热兹（Hervé Louis Ghislain Rogez）
巴西帕拉州卡帕内马（Capanema）卡帕内马农村联邦大学（Universidade Federal Rural da Amaz?nia），地址：Bar?o de Capanema大道，Caixa d’água，邮编68700-665

**摘要**
牙痛草（Acmella spp.），俗称“jambu”，能产生大量具有显著生物特性的次生代谢物——斯皮兰索醇（spilanthol）。本研究旨在评估利用Trichoderma spp.进行生物刺激对不同jambu品种的茎和花序中斯皮兰索醇含量的影响。通过超高效液相色谱法（UPLC）分析了三种品种（Jamb-03、Jamb-16和Jamb-17）在接种真菌与否情况下的斯皮兰索醇含量。实验结果表明，使用IBLF 1236（B3）和本地菌株混合物（MIX，B4）进行生物刺激后，Jamb-03和Jamb-17的斯皮兰索醇水平有所提高。在茎部，Jamb-17处理组的斯皮兰索醇浓度最高（7.90 mg/g干重）；而在花序中，Jamb-03-B3和Jamb-17-B4组的斯皮兰索醇含量分别比未接种组增加了41.8%和24.02%。尽管Jamb-16组的斯皮兰索醇含量没有变化，但其茎部生物量增加导致总产量提升。这些发现为利用Trichoderma刺激jambu品种中斯皮兰索醇的产生提供了有价值的见解。

**1. 引言**
Acmella Rich.（菊科）属植物分布于热带和亚热带地区的多个大陆，包括美洲、非洲、亚洲和大洋洲（Silva和Santos，2011）。该属包含约30个正式描述的物种，其中A. oleracea（L.）R. K. Jansen和A. ciliata（Kunth）Cass.在巴西亚马逊地区被广泛种植，通常被称为牙痛草（葡萄牙语称为“jambu”）（BFG，2015；Jansen，1985）。Acmella属植物因其丰富的次生代谢物而受到关注（Barbosa等，2016；Sharma等，2022）。其中，斯皮兰索醇（N-异丁基-2(E),6(Z),8(E)-癸三烯酰胺）是jambu作物中的主要烷酰胺，存在于茎、花序和根组织中（Bellumori等，2022）。
斯皮兰索醇具有广泛的生物活性，包括抗氧化（Sharma等，2022）、镇痛（Freitas-Blanco等，2016）、抗炎（Stein等，2021）和杀螨（Oliveira等，2018）作用，具有巨大的工业应用潜力。然而，其生物合成可能受到季节性气候变化（如亚马逊地区的雨季、过渡季和旱季）、作物管理措施（如使用植物生物刺激剂，Sut等，2020）以及水培系统生长条件（Sampaio等，2024）的影响。
除了土壤和气候因素外，Acmella spp.内部的遗传变异（Souza等，2025）也会影响斯皮兰索醇的含量（Peretti等，2021；Sharma等，2022）。因此，栽培策略可以直接或间接调节植物的次生代谢。其中一种策略是接种Trichoderma spp.。这些真菌通过生化信号传导和诱导抗性来调节次生代谢，植物最初会将真菌菌株视为潜在病原体，从而触发次生代谢物的合成（García等，2015；Guzman-Guzman等，2019）。
在番茄植株中，Trichoderma接种通过植物-真菌相互作用调节生化过程，直接影响含氮次生代谢物的产生（Iula等，2021）。此外，Trichoderma菌株可增强化学信号传导，并提高参与次生代谢途径的酶活性，如莽草酸脱氢酶（SKDH）和苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）（Yan等，2021）。
在生菜、扁豆和洋葱等园艺作物中，Trichoderma接种引发了品种特异性的响应，对生长促进（Prashar和Vandenberg，2017；Souza等，2022）、生物量积累以及黄酮类和酚类化合物的生物合成（García等，2015）产生了不同影响。这些结果与每个品种或基因型的遗传组成密切相关。
由于斯皮兰索醇是一种含氮化合物且是jambu中的关键植物化学物质，其工业价值引发了人们对其生产策略的关注。使用Trichoderma作为生物刺激剂可能有助于调节斯皮兰索醇的含量，并通过选择对生物刺激更敏感的jambu品种来标准化植物原料。因此，本研究旨在评估Trichoderma spp.生物刺激对巴西亚马逊地区本地栽培jambu品种的茎和花序中斯皮兰索醇含量的影响。

**2. 材料与方法**
2.1 **化学品和试剂**
甲醇和乙腈（MS级）购自Neon（巴西圣保罗）。乙醇和氯化钠（NaCl，分析级）购自êxodo（巴西隆德里纳）。
2.2 **植物材料及生长条件**
所使用的jambu品种（图1）为Jamb-03（A. oleracea）、Jamb-16（A. ciliata）和Jamb-17（A. oleracea），均采自巴西帕拉州（PA）东北部地区。这些品种的选择基于Souza等（2025）的形态学差异，并保存在帕拉州卡帕内马校区（Capanema）的亚马逊园艺作物研究组（GEOA）的Acmella spp.收藏库中。植物鉴定在埃米利奥·戈尔迪博物馆（Belém，PA）完成，品种编号分别为MG249017（Jamb-03）、MG249043（Jamb-16）和MG249042（Jamb-17）。
2.3 **实验设计及处理**
实验包括15个处理组（含对照组），采用双因素因子设计：第一个因素为三种Acmella spp.品种（Jamb-03、Jamb-16和Jamb-17），第二个因素为四种Trichoderma spp.接种处理。四种真菌处理中，三种为商业菌株（B1 – T. harzianum，IBLF 006 [1.0 × 101? CFU g?1]；B2 – T. asperellum，CBMAI 1622 [1.4 × 10? conidia g?1]；B3 – T. asperellum，IBLF 1236 [2.0 × 10? CFU g?1]）；另一种为本地菌株混合物（B4），即MIX（来自亚马逊生物群的T. asperellum菌株 [1.0 × 10? conidia mL?1]，已通过分子鉴定和生化分析确认）。
接种浓度（CFU g?1或conidia mL?1）按照商业产品的技术说明书进行配制，表示每克制剂或每毫升悬浮液中的活菌数量。每种jambu品种均设有未接种对照组。实验布局采用随机区组设计（RBD），方案为3 × 4 + 3因子，每个处理重复四次。每个处理包含20株植物，其中6株用于数据采集。但在收获阶段，部分处理需要调整采样方法（详见“植物采样”部分）。
2.4 **Trichoderma spp.接种**
播种后17天（即具有一对真叶阶段）的幼苗通过灌溉接种，每株接种2毫升真菌悬浮液（对照组除外）。移植前四天再次接种，将真菌悬浮液直接施用于土壤以促进真菌定植（Bucio等，2015）。使用校准过的背包喷雾器以500 mL/m2的剂量施用悬浮液。
2.5 **栽培系统**
2023年11月，幼苗在Igarapé-A?u实验农场（南纬01° 07′ 48.47″，西经47° 36′ 45.31″，海拔54米）进行栽培，该地区属于K?ppen-Geiger气候区（Alvares等，2013）。土壤类型为黄色Latosol（Embrapa，2018），在国际分类系统中对应于Ferralsols（FAO，2015）。幼苗最初在装有商业培养基（Carolina Soil?）的200孔聚苯乙烯托盘中栽培，遮荫度为30%，直至移植阶段。栽培期间的平均温度和相对湿度分别为29°C和51%。
2.6 **实验设计与处理**
实验包含15个处理组（含对照组），采用两因素因子设计：第一个因素为三种Acmella spp.品种，第二个因素为四种Trichoderma spp.接种处理。四种真菌处理中，三种为商业菌株，另一种为本地菌株混合物（B4）。
2.7 **植物采样**
所有处理的新鲜植株在开花期（2024年1月）被采集。采样在清晨（6:00–7:00）进行，每个处理重复四次，每次从一个独立实验单元（不同地块）采集一株植物。
2.8 **样品制备与提取**
冷冻样品在Wiley型刀磨机中冻干并研磨成细粉。取0.1克样品加入含1.9毫升99.5%乙醇（1:9 w/v）的试管中。试管用螺旋盖密封，在2800 rpm下涡旋30秒，然后在50°C水浴中孵育1小时（Bae等，2010）。
2.9 **斯皮兰索醇定量**
斯皮兰索醇通过超高效液相色谱法（UPLC；Thermo Scientific，Ultimate 3000）进行定量。提取物用30%甲醇稀释，通过0.22 μm PVDF滤膜过滤，取5 μL样品注入Kinetex EVO C18柱（100 ?，1.7 μm，100 × 2.1 mm，Phenomenex，美国托伦斯）。流动相为超纯水（溶剂A）和乙腈（溶剂B），均通过0.22 μm尼龙膜过滤。以0.3 mL/min的流速进行等度洗脱，最终流动相pH约为6.5，洗脱时间为30分钟。
2.10 **结果分析**
各处理的每块地块（重复）的生物量和斯皮兰索醇值（如有）见补充表2。对于合并处理的样本，统计分析为描述性而非推断性。对于B4和对照组（额外处理），样本分别单独提取，以便进行生物重复间的统计比较（补充表1）。所有采样操作均在无菌条件下进行，以防交叉污染。
2.11 **后处理**
采集后，植株依次用自来水和蒸馏水冲洗。将花序与茎（叶和茎）分离，并在-22°C下保存待分析。通过归一化峰面积分析确认了色谱纯度，并减去了分析空白中观察到的峰。通过系列稀释储备溶液构建了六点校准曲线，以量化花序和茎提取物中的spilanthol含量，R2 = 0.9985。如补充材料中所述，使用校准曲线评估了线性。通过在自动采样条件下重复注射24小时来评估标准溶液和样品溶液的稳定性。观察到峰面积或保留时间的显著变化较小，表明标准溶液的稳定性足够（相对标准偏差为5.91%）（补充材料）。通过（i）与真实标准品共注射和（ii）比较PDA光谱来鉴定样品中的化合物。根据Bae等人（2010年）的方法，基于响应的标准偏差和校准曲线的斜率计算了决定系数（R2）、检测限（LOD）和定量限（LOQ）。计算了以下变量：干重中的spilanthol浓度（mg g?1 DM）、鲜重中的spilanthol浓度（mg g?1 FM）、每株植物的spilanthol产量（mg plant?1）以及每单位面积的spilanthol产量（mg m?2），包括茎和花序。此外，为了探索spilanthol浓度与植物发育之间的关系，还测量了以下农艺性状：幼苗高度（cm）、开花天数（days?1）、茎鲜重（g plant?1）和花序鲜重（g plant?1）。

2.9 统计分析
对于辅助变量（幼苗高度、开花天数、茎鲜重和花序鲜重），使用箱线图和标准检测方法筛选异常值，并测试统计假设，包括残差正态性（Shapiro-Wilk检验和QQ图）和方差齐性（Bartlett检验）；所有假设均得到满足。由于某些处理采用了复合采样方法，因此统计分析基于收获后的有效数据结构进行，而不是严格基于原始田间设计。因此，相应地调整了统计推断。计算了标准化的欧几里得距离矩阵，并使用UPGMA方法（未加权对组方法与算术平均数）基于此差异矩阵进行了层次聚类。分析在R软件中使用Multivariate Analysis（Azevedo, 2024）和factoextra包（Kassambara和Mundt, 2020）进行。使用平均轮廓宽度方法确定了最佳聚类数量。通过共遗传相关系数（Sokal和Rohlf, 1962）评估了聚类一致性，该系数评估了原始距离矩阵与聚类结构之间的一致性。使用ComplexHeatmap包（Gu, 2016）生成了聚类热图以可视化层次分组。所有分析和图形生成均在R版本4.3.3（R Core Team, 2024）中进行。

3. 结果
3.1 茎中的spilanthol浓度
在所有茎样本中都检测到了spilanthol；然而，其浓度取决于Trichoderma处理（表1）。
表1. 在接受Trichoderma spp.生物刺激的巴西亚马逊地区Acmella spp.品种的茎的甲醇粗提取物中，spilanthol的干重浓度（SCDM）、鲜重浓度（SCFM）、每株植物产量（SPP）和每单位面积产量（SY）的值。
处理 | SCDM | SCFM | SPP | SY
--- | --- | --- | --- | ---
Jamb03-Ad | 3.67 | 0.24 | 32.42 | 80 | 9.13 |
Jamb03-B1 | 3.21 | 0.24 | 30.18 | 75 | 4.67 |
Jamb03-B2 | 4.43 | 0.35 | 35.65 | 88 | 9.74 |
Jamb03-B3 | 4.58 | 0.33 | 35.17 | 87 | 7.89 |
Jamb03-B4 | 5.32 | 0.38 | 52.31 | 13 | 10.06 |
III | 4.24 | 0.31 | 37.15 | 92 | 8.30 |
Jamb17-Ad | 4.80 | 0.33 | 39.71 | 99 | 1.42 |
Jamb17-B1 | 4.23 | 0.32 | 42.43 | 10 | 60.65 |
Jamb17-B2 | 4.07 | 0.28 | 34.14 | 85 | 2.67 |
Jamb17-B3 | 7.90 | 0.59 | 63.08 | 15 | 75.06 |
Jamb17-B4 | 5.79 | 0.43 | 46.15 | 11 | 53.23 |
III | 5.36 | 0.39 | 45.10 | 11 | 26.61 |
Jamb16-Ad | 3.93 | 0.39 | 87.82 | 21 | 98.61 |
Jamb16-B1 | 12.53 | 0.25 | 67.08 | 16 | 79.28 |
Jamb16-B2 | 2.69 | 0.26 | 63.00 | 15 | 75.65 |
Jamb16-B3 | 3.52 | 0.33 | 66.86 | 16 | 69.20 |
Jamb16-B4 | 4.10 | 0.39 | 11 | 89.72 | 29 | 71 |
II | 3.35 | 0.32 | 80.75 | 20 | 18.91 |
总体平均值* | 4.32 | 0.34 | 54.33 | 135 | 7.94 |
* 由于样本合并，报告的值是描述性的，不代表处理内的重复性或经过统计测试的处理效应。

生成了聚类热图，以基于spilanthol浓度评估不同处理的生物刺激效果。热图将主要变量与两个辅助变量联系起来：收获时的幼苗高度（sh）和茎鲜重（sfm）（图2），揭示了不同Trichoderma菌株对jambu品种平均表现的显著差异。

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图2. 基于Trichoderma生物刺激的jambu（Acmella spp.）品种茎中spilanthol浓度和农艺性状的层次分析得出的聚类热图。行代表处理，列代表变量。数据使用z分数转换进行了标准化。颜色范围从?2（红色，最低值）到+2（绿色，最高值）。值代表四个生物重复实验的平均值（n = 4），除非是合并处理，这种情况下值对应于来自四株植物的单个复合样本。SCDM：干重中的spilanthol浓度；SCFM：鲜重中的spilanthol浓度；SPP：每株植物的spilanthol产量；SY：每单位面积的spilanthol产量；sfm：茎鲜重；sh：幼苗高度。
层次聚类根据差异矩阵将处理分为三个不同的组：组I（Jamb17-B3）、组II（Jamb16-Ad和Jamb16-B4）和组III（Jamb16-B3、Jamb16-B1、Jamb16-B2、Jamb03-B4、Jamb17-B4、Jamb17-B1、Jamb17-Ad、Jamb03-B2、Jamb03-B3、Jamb03-B1、Jamb03-Ad和Jamb03-B1）（图2）。
在Jamb17-B3中观察到了最显著的spilanthol浓度（SCDM和SCFM）生物刺激效果（分别为7.90 mg/g DM和0.59 mg/g FM）。这些值比Jamb-17品种的平均值高出47.38%，并且超过了总体处理的平均值82.87%（表1）。这种优异的表现通过热图中的深绿色表示，并解释了该处理在组I中的独特聚类，表明菌株B3与Jamb-17的次级代谢之间存在强烈的相互作用（图2和补充图1A）。
尽管观察到spilanthol生物合成增加，但Jamb17-B3的幼苗较短（sh），并且在收获时的茎生物量（sfm）较低（补充表3和4）。这在热图中相应辅助变量的较浅颜色中得到体现，并导致每株植物的spilanthol产量（SPP）和每单位面积的产量（SY）降低（图2）。
为了确认Trichoderma对Jamb17-B3中spilanthol生物合成的调节作用，将其色谱谱与未接种对照（Jamb17-Ad）进行了比较，显示出峰高的明显差异（图3）。

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图3. Acmella spp.（jambu）茎的乙醇提取物的UPLC色谱图，显示spilanthol吸光强度的差异。（a）分离的spilanthol标准品；（b）Jamb17-Ad（未接种对照）；（c）Jamb17-B3（用Trichoderma菌株B3生物刺激）。
相比之下，每株植物的spilanthol产量（SPP）和每单位面积的产量（SY），作为基于生物量的最终化合物产量的关键指标，在Jamb16-Ad和Jamb16-B4（组II）中最高，特别是与组III的处理相比（图2）。这些结果与更大的鲜生物量积累密切相关，特别是在Jamb16-B4中，生物刺激促进了营养生长（补充表4），从而增加了可提取的spilanthol水平。值得注意的是，菌株B4在所有测试的jambu品种和变量中一致地引发了强烈的生物刺激反应。

3.2 花序中的spilanthol浓度
在所有花序样本中都检测到了spilanthol；然而，其通过Trichoderma生物刺激的调节作用因jambu品种和使用的真菌菌株而异（表2）。
表2. 在接受Trichoderma spp.生物刺激的巴西亚马逊地区Acmella spp.品种的花序干重中的spilanthol浓度（SIDM）、花序鲜重中的spilanthol浓度（SIFM）、每株植物的spilanthol产量（SPPI）和每单位面积的spilanthol产量（SY）的值。
处理 | SIDM | SIFM | SPP | SY
--- | --- | --- | --- | ---
Jamb03-Ad | 31.57 | 3.26 | 16.10 | 33 | 4.28 |
III | Jamb03-B1 | 24.42 | 2.64 | 9.52 | 23 | 8.87 |
III | Jamb03-B2 | 28.63 | 3.29 | 11.74 | 29 | 3.50 |
III | Jamb03-B3 | 44.77 | 4.90 | 13.43 | 33 | 5.16 |
III | Jamb03-B4 | 27.62 | 3.17 | 15.74 | 39 | 3.56 |
II | 平均值* | 31.40 | 3.45 | 13.31 | 19.07 |
Jamb17-Ad | 31.64 | 3.44 | 3.16 | 79.28 |
II | Jamb17-B1 | 33.90 | 3.39 | 5.09 | 12 | 7.01 |
II | Jamb17-B2 | 33.94 | 3.47 | 4.75 | 11 | 85 | 22 |
II | Jamb17-B3 | 32.41 | 3.52 | 3.24 | 81.37 |
II | Jamb17-B4 | 39.24 | 4.54 | 9.03 | 22 | 5.19 |
II | 平均值* | 34.23 | 3.67 | 5.05 | 12 | 6.28 |
Jamb16-Ad | 7.44 | 1.15 | 0.97 | 24.21 |
Jamb16-B1 | 5.27 | 0.97 | 1.16 | 28.88 |
Jamb16-B2 | 3.83 | 0.62 | 0.57 | 14.28 |
Jamb16-B3 | 3.79 | 0.74 | 0.45 | 11.42 |
Jamb16-B4 | 5.05 | 0.77 | 1.77 | 41.81 |
I | 平均值* | 4.49 | 0.78 | 0.99 | 24.10 |
总体平均值 | 23.57 | 2.66 | 6.45 | 156.49 |
* 由于样本合并，报告的值是描述性的，不代表处理内的重复性或经过统计测试的处理效应。
与茎数据一样，生成了热图以基于层次聚类分析可视化不同处理之间的spilanthol浓度变化。热图还结合了两个辅助变量：开花天数（df）和花序鲜重（ifm），以帮助解释每个jambu品种的表现（图4）。

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图4. 基于Trichoderma生物刺激的jambu（Acmella spp.）品种花序中spilanthol浓度和农艺性状的层次分析得出的聚类热图。行代表处理，列代表变量。数据使用z分数转换进行了标准化。颜色范围从?2（红色，最低值）到+2（绿色，最高值）。值代表四个生物重复实验的平均值（n = 4），除非是合并处理，这种情况下值对应于来自四株植物的单个复合样本。SIDM：花序干重中的spilanthol浓度；SIFM：花序鲜重中的spilanthol浓度；SPP：每株植物的spilanthol产量；SY：每单位面积的spilanthol产量；ifm：花序鲜重；df：开花天数。
层次聚类根据差异矩阵将处理分为三个不同的组：组I（Jamb16-Ad、Jamb16-B1、Jamb16-B2、Jamb16-B3）、组II（Jamb17-Ad、Jamb17-B1、Jamb17-B2、Jamb16-B3）和组III（Jamb03-Ad、Jamb03-B1、Jamb03-B2、Jamb03-B3、Jamb03-B4、Jamb17-B4）（图4）。
热图显示，组II和组III的花序每克质量的spilanthol浓度（SIDM和SIFM）高于组I，特别是Jamb03-B3和Jamb17-B4（补充图1B对于干重）。在Jamb03-B3中，SIDM和SIFM的增加伴随着花序生物量的减少（ifm），这表明可能存在菌株特异性效应，因为该品种通常产生较高的花序生物量（图4和补充表4）。
相比之下，Jamb17-B4显示出更高的spilanthol浓度以及更大的ifm和更早的开花（df）相对于组II。色谱分析证实了Trichoderma生物刺激的影响，在Jamb17-B4中spilanthol峰比未接种的Jamb17-Ad更为明显（图5）。

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图5. Acmella spp.花序的乙醇提取物的UPLC色谱图，显示spilanthol吸光强度的差异。（a）分离的spilanthol标准品；（b）Jamb17-Ad（未接种对照）；（c）Jamb17-B3（用Trichoderma菌株B3生物刺激）。
关于每株植物的spilanthol产量（SPPI）和每单位面积的总产量（SY），Trichoderma生物刺激在Jamb03-B3和Jamb03-B4（组III）中产生了显著的积极效果（图4）。如茎数据所示，菌株B3和B4是最有效的生物刺激剂，调节了响应品种的花序中的spilanthol浓度。
Jamb17-B4也记录了有希望的结果，其显示出所有菌株-品种组合中最高的与花序相关的SPPI和SY值（补充表1）。这是由于花序生物量（ifm）较大，有利于增加spilanthol的提取（图4）。相比之下，组I和II的特点是开花期较长和花序生物量较低，这两者都对总体spilanthol生产和产量产生了负面影响，这些都依赖于化合物浓度和总组织质量。
总体而言，Trichoderma菌株与Jamb-03和Jamb-17之间的共生相互作用通过B3和B4的生物刺激得到了优化，从而在茎和花序组织中实现了可测量的改进。这些发现证实了jambu对根际调节的响应性。

4. 讨论
4.1 茎中的spilanthol浓度
众所周知，栽培条件会影响jambu中次级代谢物的生物合成，无论是作为对压力的响应、土壤和气候适应机制，还是通过生物相互作用（Jer?nimo等人，2024；Sampaio等人，2024）。在这种情况下，Jamb-17 + B3处理中观察到的spilanthol响应似乎表明这是一种与特定Trichoderma-品种/基因型相互作用相关的压力诱导效应（Prashar等人，2017）。这一解释得到了幼苗阶段生长促进减少的支持（补充表3），并且与未接种对照（Jamb17-Ad）相比，茎生物量（鲜重或干重）没有显著增加。然而，这种解释仍然是推测性的，因为没有进行基因表达分析。
在Jamb17-B3茎中发现的较高spilanthol浓度可能与植物完全识别Trichoderma菌株之前激活的生化保护机制有关（García等人，2015；Guzmán等人，2019）。鉴于菌株IBLF 1236（存放在巴西圣保罗生物研究所的微生物收藏中）是亚马逊生物群落的外来菌株，它可能触发了宿主植物的更强抵抗力反应。这种反应可能涉及shikimate途径酶的激活，正如其他植物-Trichoderma相互作用中所报告的那样，这些酶有助于含氮化合物（如spilanthol）的生物合成（García等人，2015）。然而，本研究没有评估酶活性和基因表达；因此，这种解释仍然是推测性的。此外，由于Trichoderma spp.产生各种次级代谢物（Contreras-Cornejo等人，2016；Guo等人，2023），由于定殖效率的延迟，可能会对植物生长产生短暂的负面影响，这可能会进一步加剧植物的防御反应（Bucio等人，2015）。
我们的结果还支持Jamb-16没有通过增加茎中的spilanthol生物合成来响应Trichoderma接种的观察，因为每克干重和鲜重茎中的浓度在处理之间保持一致（图2）。尽管已知次级代谢产物的产生会受到环境条件的影响，但在不同品种之间以及同一品种内部观察到的spilanthol含量的变化似乎是由遗传背景（如Jamb-16的情况）和外部栽培因素（Sharma等人，2022年）驱动的，例如根际中的Trichoderma定殖。另一方面，对每株植物spilanthol产量和单位面积产量的分析表明，B4诱导的生长促进作用导致Jamb-16的spilanthol产量显著增加，这主要是由于地上部分生物量的增加（补充表4）。因此，对于使用地上部分（叶子和茎）作为原料提取spilanthol来说，Jamb16-B4似乎是一个高效且可行的选择，其每株植物的spilanthol产量和每平方米的产量分别比Jamb16-Ad增加了35.47%和35.17%。本地菌株混合物（B4）对最终spilanthol产量的显著影响，加上Jamb-16中更大的地上部分生物量，可能反映了Trichoderma菌株与它最初采集自的亚马逊土壤的生物/非生物条件之间的有利相互作用。这种适应性可能增强了其对土壤气候的适应性以及定殖效率，从而提高了生物刺激效果（Silva等人，2012年）。然而，本研究并未评估Trichoderma菌株的定殖模式（内生型与根际型）；因此，需要重新分离并进行分子鉴定以确认这些模式。

4.2. 花序中的spilanthol浓度
与地上部分不同，花序中的spilanthol含量大约是地上部分的10倍（Jamb-16除外），增幅超过了500%。这一发现证实了spilanthol在植物器官之间的分配存在差异（花序 > 叶子和茎 > 根）（Sampaio等人，2024年）。然而，由于地上部分的生物量积累更多，这些组织对每株植物和单位面积的总体spilanthol产量的贡献更大。在Jamb-16中，每克花序质量的spilanthol浓度没有受到生物刺激的影响，任何接种处理与对照组（Jamb16-Ad）相比都没有观察到增加。这可能是因为这种A. ciliata品种在巴西亚马逊地区的种植范围较窄，因此经历了较少的选择周期（Souza等人，2025年）。较低的种植强度可能导致对根际变化的抵抗力更强，减少了有利于微生物相互作用的等位基因的频率，从而限制了spilanthol生物合成的调节。相比之下，第三组的Jamb03-B3和Jamb17-B4对Trichoderma生物刺激表现出明显的spilanthol生物合成调节，直接响应了真菌的相互作用。在Jamb03-B3中，每克花序质量（干重和鲜重）的spilanthol增加可能反映了真菌定殖和识别过程中的应激反应，这与在地上部分观察到的反应类似。这些反应可能与生殖阶段的储备物质重新分配减少有关，从而改变了次级代谢产物的合成（Taiz等人，2017年；Thakur等人，2019年）。Jamb17-B4的反应则不同；其spilanthol含量的增加与应激无关，而是由于幼苗阶段的生物量积累更多（如补充表3所示）和开花时间提前（补充表4）。此外，B4还调节了Jamb-03中的spilanthol积累，这可能是由于花序快速发育的结果，从而对花序的最终spilanthol指标（SPPI和SY）产生了积极影响。尽管Trichoderma对次级代谢的影响通常在生物或非生物胁迫下加剧，但即使在没有这些胁迫的情况下也会发生调节（Thakur等人，2019年）。这一点在番茄中得到了验证，Trichoderma激活了参与代谢途径的酶和基因转录（Yan等人，2021年）。

我们的研究结果清楚地表明，第三组处理从花序提取物中产生了最高的每株植物和单位面积的spilanthol产量。这突显了基于花序作为原料的生产潜力，特别是在用B4菌株生物刺激的Jamb-03和Jamb-17中。这些改进主要与开花时间提前（df）和花序生物量增加（ifm）有关，这两种特性之前已被证明对其他作物中的Trichoderma有积极反应（Andrzejak等人，2021年）。鉴于jambu的工业重要性，特别是对其spilanthol的详细植物化学分析至关重要。考虑到品种间和植物器官间的差异，这一点尤为重要，而这些差异还可能受到栽培条件的影响（Sampaio等人，2024年；Sharma等人，2022年；Vieira等人，2021年）。本研究表明，Trichoderma生物刺激可以调节巴西亚马逊地区jambu品种的spilanthol产量，其效果因菌株和品种而异。IBLF 1236（B3）和MIX（B4）菌株在Jamb-03和Jamb-17中表现出了最有希望的结果。这些发现强调了jambu作为亚马逊本地作物的价值及其在区域生物经济发展中的作用。

5. 结论
Trichoderma菌株的接种调节了jambu品种的地上部分和花序中的spilanthol产量，调节程度取决于菌株和植物材料。IBLF 1236菌株（B3）提高了Jamb-17地上部分和Jamb-03花序中每克生物量的spilanthol含量，这可能是由于真菌定殖过程中的应激反应。相比之下，本地菌株MIX（B4）通过促进营养生长和生物量积累，更有效地提高了Jamb-16地上部分以及Jamb-03和Jamb-17花序中的总spilanthol产量和单位面积产量。因此，本研究的结果支持了为巴西亚马逊地区的jambu栽培开发创新农艺策略，并强调了选择具有响应性的基因型的重要性。它们还证实了Trichoderma作为增强这种有前景作物次级代谢和植物化学价值的工具的潜力。

数据可用性
本研究生成和分析的数据集可在Figshare仓库中找到：[https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29402300]。

资金支持
本工作得到了高等教育人员协调委员会（CAPES）的资助。[资助编号：88887.716184/2022-00]。

CRediT作者贡献声明
Francisco Laurimar do Nascimento Andrade：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，监督，项目管理，方法学，研究，资金获取，形式分析，数据管理，概念化。
Bruno José Brito Teixeira：撰写 – 审稿与编辑，方法学，研究。
Lucas da Silva Santos：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，形式分析。
Rafaelle Fazzi Gomes：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，项目管理，方法学，研究，资金获取，形式分析，数据管理，概念化。
Hervé Louis Ghislain Rogez：资源，方法学。