《South African Journal of Botany》：Development of a cell suspension system and efficient protoplast transfection for functional genomics in saffron (
Crocus sativus L.)
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本研究建立了藏红花细胞悬浮培养系统，优化原质体分离与转染流程，显著提高遗传转化效率，为分子生物学研究奠定基础。
Keshav Kumar|Joel Jose-Santhi|Avishek Mandal|Sudesh Kumar Yadav|Rajesh Kumar Singh
植物适应性与发育生物学实验室，生物技术部门，CSIR-喜马拉雅生物资源技术研究所，印度帕兰普尔
摘要
藏红花因其高价值和药用特性而成为一种非常昂贵的作物，其具有独特的生物化学特性和繁殖周期。由于多种原因，对藏红花进行基因改造具有挑战性。尽管基因工程领域取得了 recent 进展，但仍存在一些障碍，使得基因转化成为一个复杂且困难的过程。原生质培养和转染技术，特别是与植物细胞悬浮培养结合使用时，是研究这类作物分子生物学的关键工具。在本研究中，建立了藏红花细胞悬浮培养体系，以简化原生质分离和转染的过程。结果表明，添加了 2,4-D 和 Kin 的 MS 培养基在第二周促进了最大的愈伤组织生长，并采用细悬浮细胞作为接种物进行了 8 天的继代培养。通过使用标准化浓度的纤维素酶、果聚糖酶和甘露醇以及调整不同的处理时间，优化了从悬浮培养中分离原生质的方法。每毫升植物细胞体积（PCV）获得了最多的活性原生质产量，并使用增强型黄色荧光蛋白（EYFP）作为报告基因评估了转染效率。本研究成功建立了藏红花的细胞悬浮系统，实现了高效的原生质分离、纯化和转染。这一进展为未来藏红花的分子生物学研究和基因功能研究奠定了重要基础，为该作物的基因改良提供了潜力。
引言
藏红花（Crocus sativus L.），俗称“红色黄金”，是一种属于鸢尾科的草本单子叶植物。这种植物独特的花朵结构——三个雄蕊、三个柱头和六个花瓣——使其成为世界上最昂贵的香料。尤其是柱头，在食品和化妆品行业中因其调味、着色和香料特性而备受重视（Gohari 等，2013；Scarpa，2023）。藏红花的基因组为三倍体，这导致了自交不亲和性（Shokrpour，2019），限制了育种潜力和种植材料的改良。由于其克隆特性，世界上被认为只有一种藏红花品种。藏红花主要通过球茎进行无性繁殖，但球茎繁殖速度较慢。这一问题加上球茎腐烂、啮齿动物侵害以及易受多种疾病影响等因素，严重阻碍了其生产力，导致了巨大的商业损失（Sharma 等，2019）。此外，藏红花对生长和开花的严格温度要求使其越来越容易受到气候变化的影响，进一步加剧了其栽培面临的挑战。为了提高藏红花的品质，需要利用生物技术手段来增强其生产力、抗逆性和代谢产物的产生。然而，尽管藏红花具有重要的经济和药用价值，但通过生物技术方法进行改良的努力收效有限，主要是由于通过农杆菌介导的转化或其他技术实现成功基因转化存在困难（Chib 等，2020）。
研究植物分子生物学和基因功能的关键技术是基因转化；然而，许多物种缺乏有效的转化机制。农杆菌介导的转化、粒子轰击和聚乙二醇（PEG）介导的植物原生质转化是三种常用的转化策略（Lin 等，2023）。由于原生质可以直接吸收外源 DNA，因此它们是基因改造的理想受体。因此，由于其多功能性和易获取性，原生质在分子生物学、细胞生物学和植物组织培养中得到了广泛应用（Lin 等，2018）。其中一个关键应用是瞬时基因表达，即将外源基因引入目标细胞，从而能够在短时间内快速有效地分析基因功能。此外，转化后的原生质可以被选育形成愈伤组织，并进一步再生为完整的植物，最终开发出稳定的转基因品系（Reed 和 Bargmann，2021；Jeong 等，2024）。PEG 介导的原生质转化在植物中是一种流行的转染技术，因为它节省时间、安全、实用，转化效率高，且相比传统的基因转化系统对专用设备的需求较低（Shen 等，2014）。虽然针对模式植物和主要粮食作物已经广泛研究了植物原生动物的瞬时表达系统（Abel 和 Theologis，1994；Iwata 等，2011；He 等，2016；Poddar 等，2022），但藏红花独特的形态特征阻碍了这些标准方法的应用：它没有典型的宽大叶片，而是产生狭长的针状叶片，表面积有限。此外，藏红花生长习性特殊，叶片生长极少，依靠地下球茎储存，营养生长期短且处于休眠状态，这使得获取均匀的幼嫩组织极为困难（Ahrazem 等，2015）。这些解剖和发育上的限制严重阻碍了基于原生质的分子系统在藏红花中的发展。
因此，建立从愈伤组织到悬浮培养的体系是一种策略性解决方案，可以克服藏红花的独特形态限制，为高通量原生质分离和功能基因组学应用提供可持续的细胞平台。植物悬浮培养由分散在连续搅拌液体培养基中的细胞群组成。这种培养方法通常是通过将未分化的脆弱愈伤组织块转移到液体培养基中并使用合适的旋转振荡器维持搅拌来建立的（Ahuja 等，2021）。植物细胞悬浮培养被认为是整合蛋白质组学、代谢组学、基因组学以及与高价值经济代谢物合成相关的重要途径的代谢工程的有效平台。结合植物细胞悬浮培养的代谢工程可以进一步用于鉴定生物活性物质的生物合成途径，更广泛地说，它可以改变生化反应途径以分解不需要的化合物，提高目标产物的产量或减少副产物的生成（Bapat 等，2023；Khalafalla，2025）。
植物悬浮细胞被认为是最适合用于原生质分离的来源之一，因为它们提高了原生质制备的效率。因此，建立稳定的植物细胞悬浮培养体系对于获得高活力和产量的原生质至关重要（Zhang 等，2025）。原生质主要通过酶解法获得。所得原生质的效率和活力取决于多种因素，如温度、处理时间、渗透条件以及酶的类型和浓度。从悬浮培养中提取的原生质在相同的酶处理条件下表现出最高的产量和活力（Chen 等，2023）。随着原生质分离方法的进步和改进以及瞬时转化系统的开发，植物科学、遗传学、分子生物学和生物技术领域的广泛应用成为可能。原生质为植物生物学的基本方面提供了有趣的研究平台，例如基因表达调控、蛋白质定位、基因相互作用和功能表征（Fraiture 等，2014；Lin 等，2018；Chen 等，2023）。
尽管藏红花是一种具有重大经济价值的作物，但在细胞水平上的研究，特别是开发可靠的细胞培养和分离原生质方面的研究却相对较少。只有少数研究描述了藏红花悬浮培养，主要集中在次生代谢产物的生产方面（Taherkhani 等，2019），并且有一篇报告展示了从这些培养物中分离原生质的方法（Moradi 等，2020）。这些有限的研究成果凸显了建立可靠体外系统的必要性。因此，本研究旨在优化藏红花细胞悬浮培养体系，作为探索次生代谢产物生物合成、基因转化和细胞相互作用机制的平台。由于目前尚未有稳定的藏红花悬浮培养体系记录，本研究的主要目标是建立这样一个体系并进一步改进它，以便用于原生质分离和瞬时表达研究。
实验材料来源
在 PADBL 实验室（CSIR IHBT，帕兰普尔）中，使用添加了 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D，1mg/l）和激动素（Kin，0.2 mg/l）的 MS（Murashige 和 Skoog，1962）固体培养基建立的体外藏红花愈伤组织培养物通过常规继代培养进行维持和扩增，并用作实验材料。
愈伤组织悬浮培养的建立
使用愈伤组织作为接种物，在添加了不同浓度植物生长调节剂的 MS 液体培养基中建立了藏红花细胞悬浮培养
数据分析
所有实验均重复三次，数据统计分析使用 SPSS 18.0 进行单因素方差分析（ONE-WAY ANNOVA）以评估显著性差异。显著性水平为 p ≤ 0.05 时进行了 Duncan 检验。
植物生长调节剂（PGR）对愈伤组织悬浮培养建立和生长动力学的影响
使用脆弱愈伤组织作为接种物，在添加了不同浓度植物生长调节剂的 MS 液体培养基中建立了藏红花细胞悬浮培养，并基于鲜重和干重研究了四周内的生长动力学。本研究发现，在第二周时，添加了 2,4-D（1mg/l）和 Kin（0.2mg/l）的 MS 培养基记录了最大的愈伤组织生长（鲜重 1.185 g/50 ml，干重 0.0490 g/50 ml），随后是 NAA（2 mg/l）
讨论
建立悬浮培养体系的第一步是将愈伤组织悬浮在液体中。通常选择松散的胚胎愈伤组织，因为它表现出较高的细胞活力、更好的分散性、对培养环境的良好适应性、较强的增殖能力和相对较短的培养时间（Wang 等，2025）。悬浮培养基中的激素浓度和比例是影响细胞的最重要因素
结论
本研究提出了优化后的藏红花愈伤组织到悬浮培养体系方案，其中 2,4-D 和 Kin 的组合在继代培养周期内产生了最高的生物量并保持了生长。此外，还建立了高效的原生质分离和瞬时基因表达方案。这种方法使得在藏红花中开展同源基因的功能表征成为可能，而这一过程本身颇具挑战性。所开发的细胞悬浮培养体系还具有
资助
科学与工业研究委员会（MMP25301、MLP201），科学与工程研究委员会（SRG/GAP0288），生物技术部（DBT/GAP0307）。
数据可用性
本研究中分析生成的所有数据均包含在手稿和补充文件中。
CRediT 作者贡献声明
Keshav Kumar：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、实验调查、数据分析、概念构思。Joel Jose-Santhi：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、实验调查、数据分析、概念构思。Avishek Mandal：数据分析、数据管理。Sudesh Kumar Yadav：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源获取。Rajesh Kumar Singh：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、方法学设计。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们衷心感谢科学与工业研究委员会（CSIR）通过作物改良基因组编辑计划（MMP25301）提供的财政支持，以及授予 Rajesh Kumar Singh 的 CSIR 内部拨款（MLP201）。同时也要感谢 Diksha Kalia、Hrishikesh Mahato 和 Varnika Rana 的宝贵意见，以及技术支持。
