通过UPLC–MS/MS技术对大鼠肾脏中的胆汁酸进行鉴定和定量分析

《Steroids》：Bileomic identification and quantification of bile acids in rat kidney by UPLC–MS/MS

本研究通过UPLC-MS/MS首次全面鉴定和量化了 rat 肾脏中的 20 种胆汁酸（BAs），发现以酰胺化为主（69.4%），其中 CA、TCA 和 T-β-MCA 最丰富。主成分分析（PCA）显示肾脏 BA 谱与尿液显著不同，证实了肾脏组织驻留 BA 的存在，为后续机制研究奠定基础。

　　

Nilesh W. Gaikwad

Gaikwad Steroidomics实验室，美国加利福尼亚州戴维斯市，邮编95616

摘要

背景

胆汁酸（BAs）作为类似内分泌的信号分子，调控代谢、炎症、肿瘤、神经退行性病变、肝脏和肾脏过程以及细胞稳态。尽管肾脏中表达有BA受体FXR和TGR5，但直接在肾脏组织中检测到胆汁酸仍是一个挑战。

目的

利用基于质谱的胆汁组学方法，首次全面识别并定量大鼠肾脏中的胆汁酸。

方法

使用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）结合多重反应监测技术对6只雌性Wistar大鼠的肾脏进行检测。数据通过TargetLynx软件处理，并通过无监督主成分分析（PCA）与尿液数据进行了比较。

结果

在肾脏组织中检测到大约20种胆汁酸。其中酰胺化胆汁酸占主导地位（69.4%），其次是未酰胺化的胆汁酸（30.4%）和微量甘氨酸结合胆汁酸（约0.1%）。牛磺酸结合型胆汁酸比甘氨酸结合型更为常见。PCA分析显示肾脏中的胆汁酸谱型与尿液明显不同，排除了污染的可能性，证实了这些胆汁酸确实存在于肾脏组织中。

结论

本报告详细阐述了肾脏组织中的胆汁酸组成特征。这种独特的胆汁酸谱型表明肾脏具有活跃的转运、代谢和信号传导功能，为研究胆汁酸介导的肾脏生理学和疾病机制奠定了基础。

引言

胆汁酸（BAs）已从传统的肠道清洁剂角色转变为多效信号分子，通过核受体法尼索伊德X受体（FXR）和G蛋白偶联受体TGR5调节葡萄糖和脂质代谢、免疫反应及能量消耗，并与多种疾病的发生机制相关[1][2]。因此，胆汁酸通路成为治疗代谢性和炎症性疾病的潜在靶点[3]。胆汁酸信号传导的主要受体包括法尼索伊德X受体（FXR）和Takeda G蛋白偶联受体5（TGR5，也称为GPBAR-1），这两种受体已在人类和啮齿动物肾脏组织中被发现[4][5][6]。这些受体在肾脏中调节脂质代谢、水分平衡以及与肾脏生理和疾病相关的抗纤维化/抗炎途径[7][8]。

FXR和TGR5在肾脏中的信号传导具有双重作用：一方面，它们与炎症、肾纤维化、肥胖和糖尿病等病理过程相关；另一方面，它们的激活通过抗氧化、抗炎、抗脂生成和抗纤维化作用发挥肾保护作用[9][10]。尽管已有大量文献描述了胆汁酸受体在肾脏中的表达和功能，但目前尚无直接证据证明肾脏组织中存在胆汁酸及其含量。这构成了理解肾脏胆汁酸生理学的一个关键空白。

肾脏在维持胆汁酸稳态中起着关键作用，每天约有1-2微摩尔的胆汁酸被排出[11][12][13]。部分胆汁酸通过粪便排出（约1毫摩尔/天），但大多数结合型和未结合型胆汁酸通过回肠顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白（ASBT）重新吸收进入血液循环[14]。胆汁酸与多种疾病相关，包括结肠癌、胰腺癌、胆囊癌、卵巢癌和乳腺癌，以及非恶性疾病如胆结石、炎症性肠病、帕金森病和阿尔茨海默病[1][2]。除了在消化和肠肝循环中的作用外，胆汁酸还作为信号分子调节代谢、免疫、能量消耗和炎症[3][15][16]。然而，在高浓度下，它们可能具有细胞毒性和致癌性[17]。尽管许多研究对不同物种和组织的胆汁酸进行了分析[1][18][19]，但大多数研究仅针对少数几种组织类型，导致对胆汁酸分布的理解不完整。值得注意的是，目前还没有研究直接测量过肾脏中的胆汁酸含量。

分析手段方面，靶向LC-MS/MS技术能够精确定量生物流体和组织中的数十种胆汁酸[2]。然而，大多数胆汁组学研究主要集中在血清/血浆、肝脏、胆汁、粪便或尿液上，而肾脏组织的数据集较为匮乏。鉴于越来越多的证据表明肾脏存在胆汁酸转运蛋白（如ASBT/SLC10A2、OSTα/β）和受体信号通路，直接分析肾脏中的胆汁酸对于理解其生物学特性及其在肾脏健康和疾病中的作用至关重要。

在这项研究中，作为我们早期胆汁组学研究的延伸，我们首次全面鉴定了大鼠肾脏组织中的约20种胆汁酸，并通过PCA分析证实了这些发现并非由污染引起。组成分析显示酰胺化胆汁酸占主导（约69%），其次是未酰胺化胆汁酸（约30%）和微量甘氨酸结合胆汁酸（约0.1%），其中胆酸（CA）、牛磺胆酸（TCA）和牛磺-β-牛磺胆酸（T-β-MCA）最为丰富。这些结果证实了肾脏组织中确实存在胆汁酸，为未来研究胆汁酸介导的肾脏生理学和病理生理学奠定了基础。

化学物质和试剂

胆汁酸的参考标准品（表1）购自Steraloids（Newport, RI）。所用溶剂为HPLC级；其他试剂均为最高纯度产品。

动物和肾脏采集

本研究是对先前研究的扩展[2]。动物饲养和样本采集的详细方案见我们之前发表的文章[2]。为减少尿液或血液的污染，肾脏在冰上彻底冲洗后进行灌注处理，随后快速冷冻并储存在-80℃下。

结果

采用多重反应监测（MRM）模式对大鼠肾脏进行UPLC-MS/MS分析，以提高对各种胆汁酸的选择性和灵敏度。通过验证的采集和数据处理流程，我们确实在肾脏组织中检测到了20种胆汁酸（图1）。在多次重复实验中均观察到约20种胆汁酸，而MOCA、TDHCA、TUDCA、GUDCA和GDHCA在实验条件下未被检测到。

组成分析

讨论

本研究通过质谱技术详细检测并定量了大鼠肾脏中的胆汁酸，证实了这些胆汁酸是肾脏特有的，而非尿液中的残留物。对于肾脏中胆汁酸的存在及其独特组成，可以提出三种可能的机制：（1）肾脏自身的从头生物合成；（2）循环胆汁酸在肾脏中的特异性代谢；（3）胆汁酸从尿液中的吸收。肾脏与尿液中胆汁酸的明显分离进一步证实了这一点。

结论

UPLC-MS/MS胆汁组学分析显示，大鼠肾脏中的胆汁酸谱型与尿液具有显著差异。这些发现为研究胆汁酸在肾脏中的转运、信号传导和毒性机制提供了依据。

作者贡献声明

Nilesh W. Gaikwad：负责撰写、审稿和编辑，撰写初稿，进行数据分析，以及概念框架的构建。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。