整合血清代谢组学与牛奶免疫细胞分析技术，揭示了患有亚临床乳腺感染的荷斯坦奶牛的全身性和局部性免疫反应

《Italian Journal of Animal Science》：Integrated serum metabolomics and milk immune cell profiling reveals systemic and local responses in Holstein cows with subclinical intramammary infection

　　摘要：整合多层数据有助于更好地理解乳腺炎发病的病理机制，并提高检测其稳健生物标志物的能力。因此，在本研究中，我们将来自1H核磁共振（1H-NMR）的血清代谢组数据与通过流式细胞术测量的牛奶白细胞亚群以及健康奶牛（n=15，NEG）和具有自发性亚临床乳腺内感染的奶牛（n=19）的乳房健康特征相结合。我们使用了基于潜在成分的生物标志物发现数据整合分析（DIABLO）算法来合并这些数据集，并识别出用于检测sIMI的关键特征。然后通过接收者操作特征（ROC）分析评估了所选中心变量在区分NEG/sIMI动物方面的预测能力。这种方法揭示了血清代谢组数据与牛奶白细胞类别之间存在强相关性（r=0.73）。在DIABLO选出的最具信息量的特征中，我们观察到乳糖浓度增加，这是由于乳腺通透性的改变；组氨酸可能调节免疫反应。此外，与瘤胃发酵相关的代谢物（如丙酮、甲醇、乙醇和3-羟基丁酸）浓度降低表明，随着炎症的发生，能量分配从生理过程转向了免疫反应。所选代谢物的预测性能介于中等至良好之间。乳糖被证明是最有前景的生物标志物，而尿囊素显示出高敏感性（0.93）。这些发现展示了结合不同生物流体中的免疫学和代谢组学分析在乳腺炎检测中的潜力，尽管需要更大的样本量来验证其应用。

亮点：
- 奶液免疫细胞与血清代谢组变量之间存在强相关性
- 奶液白细胞与血清代谢组变量之间存在中等相关性，但与特定免疫细胞无关
- 感染动物表现出更高的乳糖和组氨酸水平
- 感染动物的瘤胃发酵相关代谢物浓度较低

关键词：乳腺炎；牛奶白细胞；代谢组；1H-NMR

引言：牛乳腺炎是一种公认的炎症性疾病，它不仅对动物福利构成威胁，还影响牛奶的生产力和质量，导致农民遭受重大经济损失（Halasa等人，2007年；Ruegg，2017年）。尽管乳腺炎是一种复杂的多因素疾病，但它主要是由多种微生物侵入乳腺引起的，可以表现为临床或亚临床形式。临床乳腺炎的特点是明显的炎症迹象和牛奶物理成分的变化，而亚临床形式通常仅表现为乳房中白细胞增殖和迁移导致的体细胞计数（SCC）增加（Bradley，2002年）。在这两种形式中，亚临床乳腺炎更具挑战性，因为其发生率是临床形式的15-40倍（Martin等人，2018年），它是牛群中未被注意的主要感染源，并增加了随后发生临床乳腺炎的风险，从而导致更高的兽医费用和提前淘汰（Wang等人，2024年）。近年来，新技术的不断进步推动了科学界对这种疾病的可靠生物标志物识别的大量研究（Mbindyo等人，2020年）。在这方面，代谢组学方法为了解特定生物流体的表型和引发的代谢途径提供了宝贵的见解。1H核磁共振（1H-NMR）光谱与质谱（MS）是代谢组学研究中最常用的两种技术。后者通常具有更高的灵敏度，但需要复杂的样本预处理，这在某些情况下可能导致代谢物的丢失（Lisuzzo等人，2024年）。相比之下，1H-NMR具有无创、易于操作和高度可重复的优点。这种分析可以采用靶向或非靶向方法进行。在靶向代谢组学中，量化一组预先定义的已知代谢物，专注于特定的代谢途径；而非靶向代谢组学旨在无偏地全面分析样本中的各种代谢物（Qiu等人，2023年）。迄今为止，1H-NMR非靶向代谢组学研究已成功用于更深入地表征患有乳腺炎的奶牛与其健康对照之间的不同代谢组特征（Zhu等人，2023年），以及识别潜在的乳腺炎生物标志物（Lisuzzo等人，2024年）。尽管取得了这些进展，但仅关注单一信息层可能只能提供乳腺炎的部分视图。虽然代谢组数据提供了宝贵的见解，但它们可能无法完全捕捉疾病的复杂性。整合来自不同生物基质的多层信息可以更全面地理解疾病发病机制，并提高稳健生物标志物的识别能力。乳腺的免疫系统在控制奶牛的炎症和感染过程中起着关键作用（Matteis等人，2020年）；然而，局部免疫反应与系统性免疫和代谢途径紧密相连。这一点尤为重要，因为科学证据表明，不同的乳腺炎致病菌可以在乳腺中引发不同的免疫反应，需要针对特定病原体的免疫反应才能有效保护（Thompson-Crispi等人，2014年）。即使在亚临床感染中，乳腺也通过细胞因子、代谢物和免疫介质与全身循环系统进行交流（Ezzat Alnakip等人，2014年），导致血液中可检测到的全身性代谢调整。同时，牛奶中的免疫细胞活性，特别是白细胞亚群的变化，可能受到支持免疫细胞功能、增殖和激活的全身性代谢变化的影响（Dervishi等人，2017年）。因此，整合来自不同生物流体（即牛奶和血清）的信息可以代表一种强大的方法，以捕捉促进宿主-病原体相互作用的协调或器官间通信机制。基于此考虑，在本研究中，我们进行了综合分析，结合了血液血清1H-NMR代谢组特征与牛奶免疫细胞亚群（即多形核细胞-PMN、巨噬细胞、T杀伤细胞、T辅助细胞和B细胞）以及具有自然发生的亚临床乳腺内感染（sIMI）的荷斯坦奶牛的乳房健康特征，这些感染由两种病原体（无乳链球菌和Prototheca spp.）引起，目的是：（i）研究牛奶免疫细胞与动物血清代谢组谱型之间的关系；（ii）识别指示sIMI的潜在中心变量。

方法：
实验设计和动物现场数据：本研究是在LATSAN项目框架内进行的，该项目旨在开发评估奶牛乳房健康的创新工具，并提高牛奶的营养和技术质量；同时也在EUPAHW项目中进行。实验程序得到了天主教圣心大学动物福利伦理委员会（OPBA）和意大利卫生部的批准（协议编号：510/2019–PR，2019年7月19日）。荷斯坦奶牛选自意大利威尼托地区的一个商业奶牛群，该群体中有450头泌乳奶牛，定期监测是否存在无乳链球菌和Prototheca spp.。群体选择基于威尼托地区动物卫生研究所（IZSVe）进行的流行病学研究，以确定该地区最常见的乳腺炎致病菌，同时也考虑到农场位置的便利性以及奶牛场操作者的合作。首先对188头多胎、处于泌乳中期的奶牛进行了细菌学筛查（时间0，T0），以识别阴性动物和由无乳链球菌或Prototheca spp.引起的亚临床感染动物。这些动物在T0后两周（T1）进行了第二次细菌学检测，在两次采样期间，农民和当地兽医定期监测这些动物，以确保它们保持亚临床乳腺炎状态。只有当所有四个乳房象限都呈阴性时，动物才被归类为阴性；如果至少有一个象限对任一病原体呈阳性，则被归类为阳性。根据T0和T1的结果，定义了三组：（i）两个时间点均为阴性且无亚临床乳腺炎史的奶牛（n=15）；（ii）细菌学检测呈阳性且患有由无乳链球菌（n=10）或Prototheca spp.（n=9）引起的亚临床乳腺炎的奶牛。此外，只有当四个乳房象限都呈阴性时才判定为阴性，否则如果至少有一个象限对任一病原体呈阳性，则判定为阳性。同时，排除了同时感染、有乳腺炎临床症状并接受抗生素治疗的动物。关于动物和实验计划的详细信息由Bisutti等人报告（2023年）。

牛奶样本的微生物学分析：牛奶样本的微生物学分析由威尼托地区动物卫生实验研究所（IZSVe）实验室（意大利莱尼亚罗）进行。收集后的冷藏样本在4°C下保存4小时，然后冷冻并在三天内进行分析。Pegolo等人（2022b）报告了分析的具体细节。简要来说，每个复合样本的10 μL被接种到以下选择性培养基中：（i）thallium kristalviolette tossin琼脂（TKT；IZSVe内部生产）和（ii）Prothoteca分离培养基（PIM；IZSVe内部生产）。疑似无乳链球菌菌落通过Christie–Atkins–Munch- Peterson测试（NMC，2017年）在24小时培养后得到确认。同时，在24小时、48小时和72小时观察Prototheca分离培养基平板，并使用湿装片方法确认疑似菌落。此外，还筛查了可能引起乳腺炎的最常见微生物，如金黄色葡萄球菌和Streptococcus uberis，以及一些环境微生物，如Streptococcus spp.、Staphylococcus spp.、Klebsiella spp.和Enterococcus spp.，以避免试验中的潜在偏差。对检测出环境微生物阳性的样本进行了排除。

牛奶成分、乳房健康特征和流式细胞术分析：从每头奶牛中收集单个牛奶样本。首先使用FT6000红外分析仪（Foss A/S，丹麦希勒罗德）对新鲜样本进行牛奶成分（蛋白质、酪蛋白、乳糖、脂肪和尿素含量）及一些质量特征（pH值和电导率（mS/cm）的测定；同时使用Fossomatic 7 DC分析仪（Foss A/S）测量SCC和差异性体细胞计数（DSCC）。每个样本的另外50 μL立即转移到帕多瓦大学（意大利）比较生物医学系（BCA）的细胞实验室，通过流式细胞术确定牛奶免疫细胞群体。所有分析在收集后12小时内完成，牛奶始终保存在4°C。详细的流式细胞术方法和分析由Pegolo等人（2022b）和Bisutti等人（2023）报告。流式细胞术分析使用CyFlow Space流式细胞仪（Sysmex Partec GmbH，德国诺德施泰特）进行，配备蓝色激光（488 nm）、红色激光（635 nm）和紫外激光。数据使用FlowMax软件版本2.82（Sysmex Partec GmbH，德国诺德施泰特）进行分析。

血清代谢物的鉴定：非靶向代谢组分析的详细信息由Lisuzzo等人（2024）报告。简要来说，使用AVANCE III光谱仪（Bruker，米兰，意大利）在298 K下获取1H-NMR光谱，频率为600.13 MHz，并配备Topspin 3.5软件。为了抑制大分子的宽共振，应用了Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）滤波器，包括400个回波，τ为400 μs，脉冲持续时间为24 μs，总滤波器持续时间为330 ms（Zhu等人，2020年）。使用预饱和技术抑制残余水信号，然后根据“滚动球”原理（Kneen和Annegarn，1996年）通过峰值检测对1H-NMR光谱进行基线校正，该原理在baseline R包（Liland等人，2010年）中实现。信号归属是通过比较化学位移（光谱上的位置）和多重性（信号形状）以非靶向方式进行，使用Chenomx软件（版本8.3，Chenomx Inc.，加拿大埃德蒙顿）完成。这是通过将获取的光谱与数据库中的纯化合物光谱进行叠加来实现的。分子定量使用矩形积分法进行，选择无干扰的信号。

统计分析：整合方法使用mixOmics R包中的DIABLO（基于潜在成分的生物标志物发现数据整合分析）算法（http://mixomics.org/，版本6.18.1；Rohart等人，2017年）进行。在整合分析之前，所有数据集的所有变量都使用算法默认参数（平均值0和方差1）进行了中心化和缩放。通过添加一个分类变量（即动物的感染状态）来评估数据集之间的关系。首次尝试在数据集中评估病原体特异性特征，但没有发现显著结果。因此，将健康奶牛（n=15）与感染个体（n=19）进行了比较。DIABLO通过建模和最大化预设数据集对之间的相关性来估计潜在成分，以揭示相似的功能关系（Singh等人，引用2019年）。具体来说，与宿主相关的特征包括使用1H-NMR测量的血清代谢组谱（n=42）；使用流式细胞术测量的牛奶白细胞亚群（n=6；免疫系统-IS）；牛奶乳房健康（UH）特征（n=6）；以及奶牛的产次和DIM（宿主）。组件数量设置为1（比实验组数量少1，实验组有2个），这根据算法开发者的建议足以实现最佳的区分性能（Rohart等人，引用2017年）。首先使用留一法交叉验证对模型进行微调，将数据分为训练集和测试集。然后，使用预测变量和类别标签的质心之间的平衡错误率（BERs）计算分类错误率。只有|r| ≥ .56的相互作用使用CIRCOS进行了可视化。DIABLO算法识别出的前20个最具信息量的代谢组变量随后被提交到MetaboAnalyst 5.0软件（https://www.metaboanalyst.ca）中。然后进行了定量富集分析，以基于京都基因组百科全书（KEGG）数据库评估受影响的途径。

为了验证上述枢纽代谢组变量作为乳腺炎感染的潜在标记物，我们使用R包pROC（v. 1.18.0）进行了接收者操作特征（ROC）和精确度-召回率分析，以量化这些标记物的感染状态预测能力。计算曲线下面积（AUC），即敏感性和1-特异性图，以检查标记物在区分感染奶牛和健康奶牛方面的准确性。

**综合分析**
图1(A)显示了不同数据集之间的相关性图。使用DIABLO方法，我们观察到Met和IS类别之间的最强协变量（r=.73），其次是牛奶乳房健康变量（UH）和免疫细胞亚群（r=.63）以及代谢组特征和牛奶乳房健康（r=.56）。正如预期的那样，当考虑与宿主类别（即DIM和产次）以及其他所有变量集的关系时，没有观察到显著的协变量（r分别为.02、.05和.16，对应于Host-IS、Host-UH和Host-Met）。尽管存在强烈的关系，但我们只观察到根据感染状态的部分聚类，并且没有明显区分S. agalactiae和Prototheca spp.阳性的动物（图1(A)）。因此，所有后续分析都是通过比较健康奶牛和sIMI奶牛来进行的，而不考虑病原体。

**图1.** 不同类别集之间的相关性图（a）；DIABLO算法识别的前20个1H-NMR代谢组变量的载荷图（b）。负载荷值（黄色条）表示相应变量在健康奶牛中的值较高。正载荷值（绿色条）表示相应变量在感染奶牛中的浓度增加。IS：免疫系统；UH：乳房健康；MET：1H-NMR血清代谢组变量；P+：对Prototheca spp.呈阳性；Sa+：对S. agalactiae呈阳性。

然后，为了更好地研究预测模型的生物学意义，我们研究了与动物感染状态具有最高共变异性的DIABLO选定特征的行为。图1(B)报告了算法选出的前20个对奶牛感染状态最具信息量的代谢物。Met数据集的第一个潜在变量显示sIMI奶牛中的乳糖和组氨酸（His）水平较高，而在健康奶牛中二甲胺、丙酮、甲醇、尿囊素和乙醇增加。其他可能与感染相关的潜在信息量代谢物包括甜菜碱、胆碱和缬氨酸。关于IS类别，DIABLO结果支持乳腺炎奶牛中免疫系统反应的激活，表现为总白细胞（尤其是多形核细胞和T杀伤细胞）的增加，以及B细胞、T辅助细胞和巨噬细胞的增加（补充图S1）。此外，关于UH类别，我们确认DSCC、SCC和酪蛋白指数是算法选出的最具信息量的变量，其中DSCC和SCC随着sIMI的出现而增加，酪蛋白指数减少（补充图S1）。

最后，CIRCOS图（图2）使我们能够更好地研究每个数据集内不同特征之间的相关性。总白细胞与大多数血清代谢特征呈负相关，特别是与甲醇（r=-.72）、二甲胺（r=-.69）、乙酸（r=-.69）和丙酮（r=-.67）。相反，总白细胞与血清乳糖（r=.70）和组氨酸（r=.57）呈正相关。在牛奶UH特征中，酪蛋白指数和乳糖与二甲胺（r=.57和.60）、丙酮（r=.56和.59）和乙酸（r=.58和.60）呈正相关，而牛奶电导率与甲醇（r=-.60）、二甲胺（r=-.63）、丙酮（r=-.62）和乙酸（r=-.63）呈负相关。

**图2.** CIRCOS图显示了每个数据集中候选变量之间的相关性。

使用算法识别的20个代谢物来识别可能受乳腺健康状态影响的潜在信息量代谢途径。乳糖和葡萄糖被纳入半乳糖代谢（Holm p值=.0013），而组氨酸同时属于组氨酸（Holm p值=.0509）和β-丙氨酸代谢（Holm p值=.0509）。

**代谢组潜在枢纽变量的验证**
作为验证DIABLO算法识别的潜在信息量代谢组生物标志物的首次尝试，我们进行了ROC分析以评估这些特征的预测能力。表1报告了DIABLO算法识别的前10个枢纽代谢组变量的详细预测能力。所有特征在区分健康奶牛和乳腺炎奶牛方面都表现出中等至良好的预测性能，敏感性>0.60，特异性>0.53，准确性>0.68，精确度>0.61。

**讨论**
即使亚临床乳腺炎是一个已知的问题，并且在了解它方面已经取得了 beberapa 进展，但最终的挑战是识别可靠的早期检测生物标志物。本研究通过结合血清代谢组学、牛奶免疫细胞群体和乳房健康特征使用DIABLO框架，提供了对亚临床乳腺内感染的第一个综合视角。这种方法不是关注单一生物标志物，而是识别多个生物层之间的相互联系，揭示了全身代谢和乳腺局部免疫活动之间的协调变化。重要的是，通过整合来自不同生物基质（血液和牛奶）的数据，能够捕捉到跨腔室的相互作用，证明全身代谢变化反映在局部免疫反应中。总体血清代谢组变量（MET）和总牛奶白细胞（IS；r=.73）类别之间的强相关性强调了多组学整合揭示功能关系的潜力，这些关系在单独分析各个数据集时并不明显。

通过排除初产奶牛和围产期动物，最小化了可能影响评估特征的变异来源（Bisutti等人，引用2023年）。实际上，在图1(A)中，宿主类别（即动物的产次和DIM）与其他所有变量类别的协变量较差。

在DIABLO识别的候选血清代谢物中，观察到乳糖和组氨酸是载荷得分最高的变量，并且在sIMI动物中增加。乳糖是牛奶中最重要的成分之一。多项科学研究观察到，患有临床和亚临床乳腺炎的奶牛中这种碳水化合物的浓度降低（Antanaitis等人，引用2021年；Pegolo等人，引用2022a）。牛奶中乳糖的减少可能归因于它是许多细菌（包括链球菌）最重要的能量底物之一（Thomas等人，引用2016年），但也可能归因于乳腺通透性的增加与紧密连接受损有关（Televi?ius等人，引用2021年），这可能导致这种碳水化合物泄漏到血液中。这些发现证实，牛奶和血液中乳糖的定量提供了乳腺通透性改变的可靠指标，这可能表明乳腺炎的存在。组氨酸在感染动物中的浓度也增加，它是一种必需氨基酸，已被证明在多种动物物种中具有抗炎作用（Moro等人，引用2020年）。特别是，其抗氧化和抗炎特性似乎与其抑制由脂多糖刺激的巨噬细胞产生的促炎细胞因子（如白细胞介素6和肿瘤坏死因子α）的能力有关（Andou等人，引用2009年）。此外，组氨酸还可能增强血浆中的抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶和红细胞中的超氧化物歧化酶的活性（Kope?等人，引用2013年）。此外，抗氧化和抗炎能力似乎与其去除活性氧（ROS）的能力有关（Lisuzzo等人，引用2022a）。先前的研究报告了牛奶（Luangwilai等人，引用2021年）、尿液（Zwierzchowski等人，引用2024年）和血清（Zhang等人，引用2022年）中组氨酸浓度的增加，这与本研究的观察结果一致。这一发现可能归因于sIMI奶牛中ROS水平的增加，正如Pegolo等人（引用2023年）所报告的。值得注意的是，组氨酸也包含在β-丙氨酸代谢途径中。β-丙氨酸是一种非必需氨基酸，它通过结合组氨酸生成肌肽，首次在糖尿病小鼠模型中被报道能有效清除活性羰基物种（Albrecht等人，引用2017年），因此可能参与清除活性物种的活动。此外，有证据表明，处于负能量平衡或其他应激条件下的奶牛可以从肌肉蛋白中动员氨基酸，导致3-甲基组氨酸的血浆浓度增加，这是组氨酸翻译后甲基化的产物（Houweling等人，引用2012年）。尽管迄今为止尚未报告与乳腺炎的直接关联，但组氨酸浓度的升高也可能反映由系统应激反应驱动的轻微肌肉分解代谢，这与活跃的炎症状态一致。总的来说，总白细胞和组氨酸之间的正相关（r=.57）进一步加强了其在调节炎症过程中的作用。

其他代谢物，如胆碱和甜菜碱，也被识别为在感染动物中水平升高的枢纽变量。胆碱是一种季胺和必需营养素，参与不同的细胞过程，包括不同磷脂的合成，这对细胞膜生物发生和细胞分化及吞噬作用至关重要（Ghorbani等人，引用2023年）。最近的证据开始强调胆碱在调节巨噬细胞激活中的潜在作用（Snider等人，引用2018年）。在乳腺炎的背景下，Bobbo等人（引用2022年）报告了高SCC的奶牛中胆碱浓度的增加，这与本研究的结果一致。甜菜碱，也称为三甲甘氨酸，是一种参与胆碱介导的一碳代谢、细胞膜完整性和信号转导的化合物（Xia等人，引用2018年），并且是一种必需的渗透保护剂（Zhao G等人，引用2018年）。最近的研究强调了其在调节核因子-κB（NF-κB）和核因子红系2相关因子2（Nrf2）信号通路中的抗炎潜力（Zhao N等人，引用2022年），这可以解释其在感染动物中水平的增加。此外，这两种代谢物与总白细胞呈正相关，进一步支持了它们在免疫调节中的潜在作用。

在DIABLO识别出的最重要的候选代谢组变量中，几种代谢物在感染动物中的浓度降低，包括二甲胺、丙酮、甲醇、尿囊素、乙醇和3-羟基丁酸（BHB）。有趣的是，sIMI动物中的BHB和丙酮浓度较低。BHB的减少可能归因于多种因素，如血糖水平升高（图1）、瘤胃运动减少和肝脏酮生成受损（Moyes等人，引用2014年）。其他研究强调了这两种酮体的增加（Dervishi等人，引用2017年；Stanojevi?等人，引用2023年），尤其是在围产期乳腺炎的奶牛中。事实上，这一发现可能与早期哺乳奶牛经常经历负能量平衡（NEB）状态有关，由于饲料摄入减少和能量需求增加，导致乳腺炎的风险增加，这是由于NEB引起的免疫抑制。二甲胺、乙醇、甲醇和尿囊素浓度的降低可能再次与sIMI动物中瘤胃发酵减少和甲烷排放变化有关。确实，乙醇、甲醇和二甲胺是瘤胃微生物代谢的产物（Lisuzzo等人，引用2022b；Fiore等人，引用2023；Zhu等人，引用2023），而尿囊素作为一种嘌呤衍生物，可以用作十二指肠水平上微生物蛋白质恢复的指标（Deshpande等人，引用2012）。有趣的是，所有这些代谢物都与牛奶中的白细胞呈负相关，这突显了炎症发生时生理和代谢过程的变化。总体而言，只有总白细胞与血清代谢物之间存在中等到高的相关性，而在考虑单个免疫细胞亚群（例如中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞）时，则没有观察到显著的相关性。这一结果可能既归因于亚临床类型的感染，也归因于我们整合了来自两种不同基质（即牛奶和血清）的信息，这可能降低了这种关系的显著性。这也解释了为什么在由无乳链球菌或Prototheca属引起的亚临床乳腺炎动物中，尽管牛奶白细胞分布存在显著差异，但血清代谢物的分布却没有观察到差异（Pegolo等人，引用2022b）。此外，可以假设系统的代谢适应可能反映了普遍的早期免疫反应，而不仅仅是针对特定病原体的反应。这一发现指向了亚临床乳腺炎的通用代谢生物标志物，这可能简化了对暴露于多种病原体的牛群的监测策略。目前研究的一个局限性可能是，由于动物是在单一时间点采样的，这可能部分解释了代谢组变量与牛奶中单个免疫细胞群体之间的弱相关性。因此，没有关于感染阶段或进展的信息，而这可能会影响免疫和代谢特征。此外，乳腺中的局部免疫反应和系统代谢改变可能以不同的时间动态发生，从而可能在牛奶中可检测到的变化与血液中可测量的变化之间引入延迟。这一局限性在亚临床乳腺炎的背景下尤为重要，因为亚临床乳腺炎的特点是轻微且通常是局部的炎症反应，可能不会引起强烈的系统代谢改变。这需要在未来的纵向研究中监测代谢组和免疫相关变量随时间的变化。此外，为了加强和验证本研究获得的结果，增加研究动物的样本量是至关重要的。

在枢纽代谢物中，ROC分析显示乳糖在区分sIMI奶牛方面的预测性能最高（AUC = 0.91），进一步强调了其在乳腺炎检测中的关键作用。此外，尿囊素也显示出有希望的预测性能，尤其是在敏感性方面（= 0.93）。由于这种代谢产物通常是尿酸与ROS物种结合的结果（Lalwani等人，引用2015），进一步探索其作为细胞损伤或炎症过程生物标志物的作用将是很有趣的。虽然这些结果很有前景，但它们的预测性能仅使用了当前研究的数据库进行评估。因此，需要在独立且更大的队列中进行外部验证，以确认这些发现的稳健性和普遍性。最后，将系统数据与牛奶代谢组谱整合起来，对于提供更详细的乳腺炎发病机制图谱和加强候选标志物的识别至关重要。

结论

本研究首次综合分析了由无乳链球菌和Prototheca属引起的sIMI情况下牛奶免疫细胞亚群和血清代谢组特征。有趣的是，我们观察到免疫学和代谢组变量之间存在显著相关性，尽管它们来自两种不同的基质。血清代谢组变量与牛奶中的总白细胞有中等程度的相关性，但与单个免疫细胞群体无关，这可能反映了亚临床感染的轻微和局部性质。在算法选出的最具信息量的变量中，乳糖和组氨酸最为显著，它们在sIMI动物中的增加表明了后者在调节免疫反应中的作用。此外，观察到的参与瘤胃发酵的代谢物减少可能表明，随着炎症的发生，用于维持生理过程的能量可能会被重新定向用于支持免疫反应。最后，ROC分析进一步证实了乳糖作为乳腺炎检测的强大生物标志物的作用，并提出尿囊素是一个值得进一步研究的潜在特征。总体而言，这些发现展示了结合不同生物流体的免疫学和代谢组分析来捕捉奶牛亚临床乳腺炎早期和微妙系统特征的潜力。这种多生物流体方法对于亚临床情况特别重要，因为在这些情况下，单一生物标志物可能缺乏足够的敏感性，因此可能有助于开发奶牛场的精准监测工具。未来对更大规模和纵向监测的队列的研究对于验证这些结果及其转化应用性至关重要。

作者贡献

SP构思了这项研究。VB参与了采样活动。AL和EF进行了代谢组分析和数据解释。MEG协助了流式细胞术分析。AC参与了实验设计。VB进行了整合分析。VB、SP和DG参与了数据解释。VB撰写了初稿。所有作者都审阅并批准了最终稿件。

补充材料

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