综述：免疫荧光方法占主导时期“老式”电子显微镜的成就

《International Journal of Molecular Sciences》：Accomplishments of “Old-Fashioned” Electron Microscopy in the Period of Dominance of Immunofluorescent Methods Yury M. Morozov and Pasko Rakic

本综述推荐“老式”透射电子显微镜，其在免疫荧光方法主流的今天，凭借高分辨率与全景分析能力，揭示细胞结构与病理细节。文章展示了多个意外发现，如抗CB1R血清对线粒体蛋白SLP2的双重识别，为原位鉴定线粒体蛋白复合物解离和坏死样细胞死亡提供了新方法，并揭示了核膜与质膜同时破裂的新型病理“刺穿性核疝”，以及中心体锚定在脑皮层侧向扩张中的作用。

　　

在免疫荧光显微技术高度发达的今天，透射电子显微镜（TEM）以其无与伦比的超高分辨率和对细胞、细胞器的全景式观察能力，展现出独特价值。它不仅能够验证免疫标记结果，避免误读，更能揭示荧光显微镜无法捕捉的形态功能细节。本篇综述汇集了多项基于TEM的前沿研究，展示了这项“经典”技术在解决现代生物学复杂问题中的关键作用。

解读抗大麻素1型受体血清与线粒体的结合

使用抗体进行蛋白质免疫组化鉴定是细胞与分子研究的利器，但需注意技术问题，特别是构象表位的识别可能受实验条件影响，导致结果不确定。例如，在哺乳动物脑大麻素信号研究中，发现抗大麻素1型受体（CB₁R）血清能与两种形态功能类型的线粒体结合，而许多其他线粒体呈免疫阴性。深入分析发现，该血清除了结合CB₁R，还能识别线粒体蛋白SLP2的构象表位。因此，对不寻常的免疫标记类型进行解读时需格外谨慎，TEM在此可提供关键帮助。

抗CB₁R血清检测小鼠脑内紊乱的线粒体与受损细胞

结合免疫过氧化物酶反应和免疫金-银标记，研究团队检测到抗CB₁R血清与线粒体结合的两种模式。其中，2型线粒体的出现与细胞紊乱相关。在正常发育的小鼠脑中，可零星检测到含有2型免疫阳性线粒体的神经毡区域，而周围组织呈免疫阴性。电镜分析显示，这些细胞呈现从轻微到严重的超微结构病理。因此，2型线粒体表型为原位诊断细胞变性提供了新靶点。

CB₁R-L31免疫标记揭示的线粒体功能

SLP2是一种位于线粒体内膜、面向基质的组成性蛋白，参与线粒体功能。研究发现，在功能正常的线粒体中，SLP2因其表位被其他分子紧密结合而无法被抗体识别。当SLP2从复合物中释放，便可与CB₁R-L31抗体结合。1型线粒体形态正常，标记产物位于外膜和嵴内，可能代表新合成的SLP2分子停靠在线粒体表面待转运。2型线粒体则呈现中度或显著肿胀，抗体标记其基质，这对应于SLP2位于内膜内侧的现代观点。因此，抗CB₁R-L31标记可检测处于早期或晚期病理阶段的细胞。

利用2型线粒体鉴定小鼠脑内的坏死样细胞超微结构病理

利用抗CB₁R-L31血清对SLP2进行免疫组化标记，是鉴定紊乱细胞的便捷方法，因为2型线粒体在光镜下易于识别，并可进行定量分析。研究发现，缺氧条件会导致小鼠胚胎脑内2型线粒体数量显著增加，并与细胞坏死样超微结构病理相关。重要的是，未发现细胞凋亡或自噬的超微结构证据。这表明，低体温疗法对新生儿缺氧缺血性脑病的治疗机制是基于对坏死的抑制而非凋亡。因此，2型线粒体的免疫标记可作为原位检测线粒体紊乱和坏死样细胞死亡的目标。

高尔基体紊乱先于缺氧诱导的线粒体病理

通过电镜三维重建定量分析发现，在缺氧早期，线粒体出现2型上调约有3小时延迟，但高尔基体（GA）在缺氧1小时后即发生重塑，形成“洋葱样”结构，这是小鼠胚胎脑对缺氧条件最早期的形态功能反应。研究发现，缺氧1小时后快速复氧，大多数GA的超微结构可恢复；但缺氧3小时后再复氧，则无法逆转细胞损伤。这表明，GA功能障碍可能是可逆的，但如果持续能量短缺，GA功能受损会波及其他细胞器，如线粒体。2型线粒体数量的急剧增加，很可能标志着细胞坏死样死亡的“不归点”。

2型线粒体鉴定肝脏和白色脂肪组织中的坏死样细胞死亡

研究将CB₁R-L31血清的应用扩展到其他组织和器官。在年轻小鼠肝脏中极少观察到2型免疫阳性线粒体，但在老年小鼠肝脏中则大量存在，并集中于特定肝细胞，这些细胞呈现线粒体分裂、肿胀和其他细胞器破坏的坏死样病理，而邻近免疫阴性细胞则保持正常。在成年小鼠腹部白色脂肪组织中也检测到2型线粒体，其出现伴随着所有线粒体的分裂肿胀以及细胞质和其他细胞器的紊乱。这表明，SLP2样免疫阳性2型线粒体的免疫组化检测可作为不同组织和器官中坏死样超微结构病理和细胞死亡的标记。

线粒体蛋白复合物解离鉴定坏死样细胞死亡

在病理条件下，许多线粒体蛋白复合物可能发生类似行为。从复合物中释放的SLP2可作为线粒体功能障碍和细胞紊乱的新型免疫组化标记。研究者提出使用抗CB₁R-L31血清进行原位鉴定，以发现可能指示坏死样细胞死亡“不归点”的线粒体蛋白复合物解离。该方法弥补了当前流行方法（如TUNEL检测和活性caspase免疫标记）主要检测凋亡样调节性细胞死亡的不足。

刺穿性核疝是迁移细胞的新型超微结构病理

近期，利用超薄切片电镜和完整三维重建，研究者在迁移神经元中发现了局部内核膜和外核膜破裂，并伴有染色质疝出到细胞质中的现象，即核膜（NE）破裂。令人惊讶的是，在一部分迁移神经元中，疝出的染色质流不仅突破了核膜，还撕裂了质膜，将细胞质和核质暴露于细胞间隙。研究者将这种首次描述的NE和质膜同时破裂的细胞病理命名为“刺穿性核疝（PNH）”。NE和质膜在PNH中的破裂严重破坏了膜的屏障功能，显然会导致细胞快速死亡。发生PNH的细胞常伴有细胞器的超微结构病理，如线粒体变短。内源性大麻素信号紊乱参与PNH的发生，表明其属于调节性细胞死亡机制，但膜的快速破裂又类似于意外性细胞死亡。因此，PNH代表了一种可能对细胞致命的新型细胞病理。

大麻素信号在细胞骨架功能中的作用

研究表明，染色质疝出的概率在内源性大麻素系统紊乱时增加。CB₁R敲除小鼠胚胎和暴露于不同CB₁R激动剂的野生型胚胎中，许多迁移神经元显示NE破裂或PNH。这表明，内源性大麻素系统功能偏离最佳状态（活性不足或过度）可能触发增加膜脆弱性和染色质疝出的机制。疝出染色质的巨大体积表明，NE破裂和PNH是细胞核在发育大脑中移动时核内压力极高的结果。内源性大麻素系统紊乱与NE破裂和PNH之间的关联提供了证据，表明最佳的内源性大麻素信号对于迁移神经元中的细胞骨架功能至关重要。

细胞骨架在脑皮层侧向扩张中的作用

通过识别中心体（作为微管组织中心起关键作用）的超微结构，研究团队对细胞骨架进行了定量形态功能表征。他们发现了顶端神经祖细胞（NPC）分裂后，锚定与游离中心体比例存在显著的物种特异性差异。中心体的锚定动力学可能影响顶端NPC向基底NPC的转化。具体而言，NPC顶端锚定的增加可能延长顶端神经发生和大脑皮层的侧向扩张。研究发现，小鼠中中心体锚定率较高，而在猕猴中，中心体在细胞质中长时间游离的状态为大脑皮层的侧向扩张提供了更多机会，这是灵长类动物认知能力的关键基础。这些观察结果支持了大脑扩张的放射单位假说。该假说提出，脑室增殖率的增加会产生更多放射单位，从而导致大脑中细胞层的扩展，最终使平滑的大脑皮层转变为有脑回的结构。