《Plants》：Cell Wall Invertase Inhibitor SlINVINH1 Acts as a Negative Regulator in Fruit Ripening of Tomato
Siran Chen,
Hongjian Wan,
Jiaxiang Wei,
Yonghua Liu and
Jun Li
编辑推荐：
本研究聚焦糖代谢如何影响果实成熟这一尚未完全阐明的问题。研究人员针对番茄细胞壁转化酶抑制剂SlINVINH1，利用CRISPR/Cas9技术开展基因敲除研究。结果发现，敲除该基因可提前2-3天启动果实成熟，并伴随CWIN活性、蔗糖/葡萄糖/果糖及类胡萝卜素含量的增加。这揭示了SlINVINH1是果实成熟的负调控因子，为通过调控CWIN抑制剂基因来同步加速果实成熟和增加甜度提供了新的遗传育种策略。
想象一下，你从市场买回的番茄，有时硬邦邦、青涩寡淡，有时却已熟透、风味十足，甚至开始变软。决定果实何时成熟、有多甜美的幕后“指挥官”究竟是谁？科学家们一直知道，糖代谢在这一过程中扮演着关键角色，但其中的精细调控网络，尤其是那些“踩刹车”的抑制因子，仍笼罩在迷雾之中。在植物体内，有一种名为细胞壁转化酶（Cell Wall Invertase, CWIN）的蛋白，它能将植物运输的主要糖分——蔗糖，不可逆地水解为葡萄糖和果糖，直接影响果实中的糖分积累。而CWIN的活性，又受到一类名为转化酶抑制剂的蛋白质调控。然而，这类抑制剂是否以及如何影响果实成熟本身，而不仅仅是糖含量，此前鲜有报道。发表在《Plants》上的这项研究，便揭开了番茄中一种CWIN抑制剂——SlINVINH1的神秘面纱，发现它竟是一个掌控番茄成熟启动的“总开关”之一，而且是一个不折不扣的“负向”调控者。
为探究SlINVINH1的功能，研究人员运用了CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了两个独立的番茄SlINVINH1基因敲除突变体株系。通过对比突变体与野生型，系统分析了果实成熟表型、多种糖分与色素含量、相关酶活性。为了从分子层面揭示机制，他们对不同成熟阶段的果实样本进行了转录组测序与分析，筛选差异表达基因并进行功能富集分析，同时利用qPCR（实时荧光定量PCR）对关键基因的表达模式进行了验证。
2.1. 敲除SlINVINH1加速番茄果实成熟
研究人员首先通过在线数据分析和qPCR验证，发现SlINVINH1在果实成熟起始阶段高表达，提示其可能参与成熟调控。接着，他们利用CRISPR/Cas9技术敲除了该基因，获得了两个纯合突变体。表型观察发现，与野生型相比，突变体果实的成熟启动时间提前了2-3天，在野生型果实仍为绿色时，突变体果实已转变为橙色。这直接证明SlINVINH1的缺失加速了果实成熟，表明其本身是一个成熟抑制因子。
2.2. 分析SlINVINH1敲除系在成熟过程中的转化酶活性及糖、叶绿素和类胡萝卜素含量
由于SlINVINH1被证实能与CWIN互作，研究人员检测了相关酶活和代谢物。结果显示，在突变体果实中，CWIN和液泡转化酶（VIN）的活性在多个时间点显著升高，而细胞质转化酶（CIN）活性则下降。相应地，蔗糖、葡萄糖和果糖的含量在突变体果实中均显著增加。同时，标志成熟进程的生理变化也发生了：与野生型相比，突变体果实中叶绿素含量持续降低，而类胡萝卜素含量持续升高。这些数据表明，SlINVINH1的缺失通过上调CWIN活性，改变了糖代谢流，并促进了成熟相关的色素转化。
2.3. SlINVINH1敲除系果实成熟过程中的转录组分析
为了从全局基因表达层面探究机制，研究人员对突变体和野生型不同成熟阶段的果实进行了转录组测序。分析发现，每个时间点都有超过2000个差异表达基因。这些基因显著富集在与细胞壁、水解酶活性相关的GO（Gene Ontology, 基因本体论）条目，以及与果实成熟和/或糖代谢相关的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, 京都基因与基因组百科全书）通路，如植物激素信号转导、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路-植物、淀粉和蔗糖代谢等。在三个时间点共有的353个差异表达基因中，近三分之二编码转录因子，KEGG富集分析进一步聚焦于苯丙氨酸代谢、MAPK信号通路-植物、类黄酮生物合成等与成熟密切相关的通路。
2.4. SlINVINH1敲除系果实成熟过程中转化酶及其抑制基因的表达分析
转录组和qPCR数据显示，在突变体中，主要的CWIN基因SlLIN5表达上调，这与CWIN活性升高一致；CIN基因表达普遍下调，与CIN活性降低相符。液泡转化酶抑制基因SlVIF的表达模式则复杂多变。SlINVINH1自身的转录水平在突变体中（因基因编辑）大幅降低，而另一个CWIN抑制基因SlINVINH2在成熟期果实中几乎不表达。这些结果从基因表达层面印证了酶活和糖分的变化。
2.5. SlINVINH1通过调控关键成熟相关标记基因的表达影响果实成熟
研究人员进一步分析了一组关键的成熟相关标记基因的表达。结果显示，在SlINVINH1敲除突变体中，包括全局成熟调控因子SlRIN（ripening inhibitor）在内的几乎所有检测的标记基因（如SlNOR, SlLePG, SlEXP1, SlACS2, SlACO1, SlPSY1, SlPDS）的转录水平在多数成熟时间点都大幅升高。这表明SlINVINH1很可能通过负向调控这些核心成熟基因的网络来延缓成熟进程。
结论与讨论
本研究首次揭示了植物CWIN抑制剂在调控果实成熟中的新功能。番茄CWIN抑制剂SlINVINH1是果实成熟启动的负调控因子。敲除该基因可提前启动成熟，并伴随CWIN活性升高、糖分（蔗糖、葡萄糖、果糖）和类胡萝卜素积累增加、叶绿素降解加速。转录组分析表明，这一过程涉及大量与成熟和糖代谢相关基因的表达重编程，特别是关键成熟标记基因（如SlRIN）的上调。讨论部分将本研究的发现与之前关于液泡转化酶抑制剂SlVIF的研究进行了对比，指出两者对番茄果实成熟（SlINVINH1负调，SlVIF正调）和蔗糖含量（SlINVINH1敲除和SlVIF过表达均增加蔗糖）的影响存在有趣差异，推测其原因可能与它们对蔗糖含量的不同影响或亚细胞定位差异有关。值得注意的是，SlINVINH1和SlVIF都是成熟主效调控因子SlRIN的直接靶标，但受SlRIN调控的方向相反，这可能部分解释了它们功能的拮抗性。本研究的意义在于，它不仅为理解果实成熟的复杂调控网络提供了新视角，更重要的是，提出了一种全新的遗传育种思路：通过操纵SlINVINH1等CWIN抑制剂基因的表达，有可能实现同步加速果实成熟和增加果实甜度的双重育种目标，在番茄乃至其他果蔬作物的遗传改良中具有潜在的重要应用价值。
