《Analytica Chimica Acta》：A power-free sample-loading microfluidic chip integrated with a colorimetric loop-mediated isothermal amplification and a chromatic analysis via image processing for multiplex detection of parasitic diseases
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微流控芯片集成环介导等温扩增（LAMP）与色谱分析技术，实现五种胃肠寄生虫同步检测，灵敏度达4-40pg/chip，与金标准方法Kappa值达0.93且无显著差异，为便携式多病原检测提供新方案。
作者：Wasin Panich、Chokchai Puttharugsa、Thanawan Tejangkura、Thapana Chontananarth
泰国曼谷Srinakharinwirot大学理学院生物系应用寄生虫学研究实验室，邮编10110
摘要
胃肠道蠕虫寄生虫的金标准诊断方法是基于成虫的形态特征进行鉴定，以及利用浮选或沉淀技术从宿主粪便中分离虫卵阶段。这两种方法耗时较长，需要技术技能和寄生虫学知识。在我们的研究中，我们开发了一种无需电源的微流控芯片，该芯片集成了比色环介导等温扩增（LAMP）和彩色分析技术，用于多重寄生虫疾病的检测。该微流控芯片可以同时检测五种寄生虫。检测结果可以通过肉眼观察或通过图像处理进行彩色分析得出。该检测方法对R. echinobothrida、R. tetragona、R. cesticillus、A. galli以及Echinostomatidae科具有特异性，最低可检测DNA浓度范围为4 ng至40 pg/芯片。在粪便样本上的检测性能与金标准方法高度一致（Cohen’s kappa值=0.93）；McNemar检验显示两种方法之间无显著差异（p > 0.05）。因此，所提出的检测方法具有广泛应用于多种病原体和传染病的潜力。
引言
胃肠道蠕虫寄生虫的金标准检测方法是通过尸检直接观察成虫的形态特征，以及利用浮选或沉淀技术检测宿主粪便中的虫卵阶段[1]、[2]、[3]。尽管虫卵检测显示出与寄生虫负荷的中等到强相关性，但其诊断结果并不总是准确的。这主要是由于多种因素造成的，例如粪便样本中虫卵分布不均、感染早期未产生虫卵、以及雄性虫体的感染（尤其是在雌雄异体的寄生虫群体中）[4]、[5]、[6]。此外，这些传统技术需要技术技能和寄生虫学知识来操作，并且区分不同的寄生虫群体非常耗时，尤其是在同时检测大量样本时。
为了简化用户操作流程，基于分子DNA扩增的技术被用作替代方法，因为这些方法只需要少量寄生虫组织的DNA即可进行检测。这些技术比形态学方法更可靠、更快捷、更方便。关于粪便中寄生虫的分子检测技术，Sow等人[7]使用定量聚合酶链反应（qPCR）检测人类中的胃肠道寄生虫；Rojas等人[8]使用高分辨率熔解（HRM）与qPCR结合检测狗体内的；Reslova等人[9]应用多重qPCR检测羊粪便中的胃肠道线虫；Tarbiat等人[2]开发了双链滴式数字PCR来检测鸡粪便中的Ascaridia galli和Heterakis gallinarum>感染。然而，这些方法需要复杂的或专用仪器，如热循环仪，这在成本和实验室外使用的可行性方面存在显著限制[10]、[11]。
与PCR相比，环介导等温扩增（LAMP）更适合现场检测，因为它在单一恒定温度下进行，只需便携式水浴或加热块[12]。LAMP产物可通过浊度测量、比色法和荧光探针检测，但在多重LAMP检测方面无法区分不同产物，而凝胶电泳在实验室外设置较为困难[13]。侧向流动试纸条（LFD）检测方法可以通过用特定试剂（包括生物素、地高辛、Texas Red、荧光异硫氰酸酯（FITC）和6-羧基荧光素（FAM）标记LAMP引物和探针来区分多种LAMP产物[6]、[14]、[15]、[16]。尽管有报道称LFD检测方法能够区分多重LAMP产物[13]、[14]、[15]、[16]，但多重LAMP反应通常需要至少两组LAMP引物（8个引物），这会导致这些引物竞争Bst DNA聚合酶和其他试剂，并且难以优化多重LAMP反应[17]。
微流控芯片技术（也称为芯片实验室）结合DNA扩增技术，可以通过设置不同的反应室来检测不同的目标病原体，如Hu等人[11]、Nguyen和Seo[18]、Nguyen等人[19]、Chen等人[20]、Phan等人[21]以及Lou等人[22]所报道的。他们指出，样本加载和结果分析需要使用自动设备，任何额外的设备都会使现场检测变得更加复杂。然而，其他研究也成功地使用纸张、真空力和简单移液器实现了无需电源的样本加载，而微流控芯片上没有内置的自动检测器[17]、[23]、[24]、[25]。这些研究主要关注基于溶液变色的定性结果（感染或未感染），这可以通过肉眼观察到。尽管肉眼比色法最简单快捷，但受个体因素（如颜色感知、经验、潜在色盲和环境光线）的影响，可能导致误差或结果可靠性较低[26]。因此，为了消除这些因素并提高结果的可靠性，需要数值测量。在彩色分析中，使用了多种颜色空间（如RGB（红、蓝、绿）、HSB（色调、饱和度、亮度）和CIELab）来区分比色LAMP检测的阳性与阴性结果[27]、[28]、[29]、[30]。
因此，我们的目标是开发一种无需电源的微流控芯片，该芯片集成了比色LAMP和通过图像处理的彩色分析技术，用于同时检测鸡体内的三种寄生虫群体，即Raillietina属的绦虫（R. echinobothrida、R. tetragona和R. cesticillus>）、线虫A. galli以及Echinostomatidae科的吸虫（Echinostoma miyagawai、E. mekongi、E. macrorchis和Hypoderaeum conoideum）。
部分内容
寄生虫样本来源和DNA制备
本研究使用的所有寄生虫样本（成虫阶段）均来自Panich等人之前的研究[6]，详见表S1。根据制造商说明，使用GF-1组织DNA提取试剂盒（Vivantis）提取每种物种的基因组DNA。提取的DNA用分光光度计（Thermo Scientific? NanoDrop? One Microvolume UV–Vis Spectrophotometer）测量，并用去离子水稀释至最终浓度10 ng/μL，用于所有实验微流控芯片上的比色LAMP反应
为了在微流控芯片平台上实现比色LAMP，反应在65°C下进行90分钟。结果表明，所有五组LAMP引物都能在微流控芯片平台上扩增目标DNA，且颜色变化可通过肉眼观察到，凝胶电泳显示梯形图案（图S3）。关于从芯片中扩增出的五种LAMP产物，1 μL的LAMP...讨论
Raillietina、A. galli和Echinostomatidae寄生虫的致病性是由于它们具有粘附器官，如星状钩、棘刺和吸盘，这些器官用于附着并穿透宿主的胃肠道。这会损伤肠道黏膜，导致类似的临床症状，如肠炎、腹泻、厌食和消瘦。这些症状会降低宿主吸收营养的能力，从而减缓生长速度，导致体重下降
结论
我们开发了一种无需电源的微流控芯片，该芯片集成了比色LAMP和通过图像处理的彩色分析技术，用于多重寄生虫疾病的检测。LAMP反应后90分钟，通过图像处理可以解释彩色分析结果。所开发的检测方法能够同时检测五种寄生虫目标，即R. echinobothrida、R. tetragona、R. cesticillus、A. galli以及Echinostomatidae科CRediT作者贡献声明
Wasin Panich：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、验证、方法学、研究、数据管理。Chokchai Puttharugsa：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、验证。Thapana Chontananarth：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。Thanawan Tejangkura：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、验证、方法学伦理批准
所有与动物相关的实验方法均经过泰国国家研究委员会批准，并获得Srinakharinwirot大学动物护理和使用委员会（许可证编号SWU-A-09-2568）的许可。利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：本研究中的微流控芯片设计和制造过程正在泰国知识产权部门（DIP）进行小型专利注册（注册编号：2503002860）。致谢
我们感谢泰国Srinakharinwirot大学、泰国国家研究委员会（NRCT）和泰国科学成就奖学金（SAST）提供的研究资助。
