通过非均匀采样技术加速二维HSQC核磁共振（NMR）分析，实现对烟草半纤维素的快速结构表征

《Carbohydrate Research》：Rapid structural characterization of tobacco hemicellulose via Non-Uniform Sampling accelerated 2D HSQC NMR

本研究采用深熔盐溶剂（DES）提取烟草不同部位半纤维素，结合非均匀采样（NUS）与二维异核单量子相干核磁共振（2D HSQC NMR）技术，优化25%采样比例，实现产率达63.97%且结构完整。发现叶、茎、茎、根半纤维素分别以AG/GAX、GAX、GX为主，方法显著缩短NMR时间约五倍，为农业废弃物高值利用提供新工具。

　　

作者：Along Zhou、Changguo Wang、Jinfeng Wu、Lijun Zhu、Ming Ma、Jinghang Hao、Zhicheng Liu、Shouhu Xuan、Shaolin Ge、Jun Yang

中国科学技术大学化学与材料科学学院，合肥 230026

摘要

半纤维素的结构对农业废弃物的高价值利用具有重要影响，因此对其特性进行表征至关重要。在本研究中，使用深共晶溶剂（DESs）从烟草中提取了半纤维素，并通过将非均匀采样（NUS）技术与二维异核单量子相干核磁共振（2D HSQC NMR）相结合，建立了一种快速的结构表征方法。研究了烟草叶片、茎、秆和根中半纤维素的结构差异。比较了三种DES：氯化胆碱-单乙醇胺（C-M）、氯化胆碱-甘油（C-G）和氯化胆碱-甲酸（C-F）。其中，C-M体系获得了最高的半纤维素产率、去除率和最佳的结构保留效果。在优化了温度、时间和固液比后，C-M体系的产率达到63.97%。在NUS比例为40%、35%、30%、25%和20%的情况下，分别评估了2D HSQC NMR的结果，最终选择25%作为最佳比例。这种25% NUS/2D HSQC NMR方法在光谱分辨率、实验耗时和结构信息含量方面均优于传统的2D HSQC NMR方法，将NMR时间缩短了约五倍，相对误差在0.12%–1.26%之间。通过该方法发现，烟草叶片中同时存在阿拉伯半乳聚糖（AG）和葡甘露聚糖（GAX）结构；茎主要由葡甘露聚糖（GAX）构成；而秆和根则主要以葡甘露聚糖（GX）为主。该NUS/2D HSQC NMR方法实现了半纤维素的快速、准确表征，为农业废弃物的高价值利用提供了有效的分析工具。

引言

木质纤维素生物质（LCB）作为一种环保且可再生的植物资源，近年来在生物能源和高价值利用领域受到了广泛关注[1]。LCB中形成了稳定的复合网络结构，其中纤维素微纤维作为骨架，而半纤维素和木质素通过交联结合在一起[2]。纤维素是一种线性聚合物，主要由β-D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成，是植物细胞壁中最丰富的天然多糖[3]。半纤维素属于杂多糖，其在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素。其聚合物结构包括木聚糖、木葡聚糖、甘露聚糖（半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖）和混合键合的β-葡聚糖等，这些结构由戊糖（β-D-木糖、α-L-阿拉伯糖）、己糖（β-D-甘露糖、β-D-葡萄糖）和尿酸（葡糖醛酸、半乳醛酸）等单糖通过β-1,4-糖苷键构成[4]。半纤维素已从多种植物中提取出来，并经过功能修饰后应用于食品包装和药物递送等领域以实现高价值利用[5][6]。烟草是一种重要的高产农业经济作物，然而每年生产的原材料中约有四分之一被作为废弃物丢弃[7]。这些废弃物大多被直接丢弃或焚烧，导致其中半纤维素资源的利用不足[8]。烟草半纤维素的结构特性是其高价值利用的关键因素。因此，建立高效的提取方法和表征技术对于提高其资源利用率具有重要意义。

目前，半纤维素的主要表征方法包括高效液相色谱（HPLC）、凝胶渗透色谱（GPC）、气相色谱-质谱（GC-MS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和核磁共振（NMR）光谱，这些方法可用于获取半纤维素的单糖组成和糖苷键合模式等信息[9]。由于NMR具有无损表征和高分辨率的优势，被认为是阐明材料结构的重要工具。常见的NMR方法包括一维（1D）质子NMR（¹H NMR）、碳NMR（¹³C NMR）和二维（2D）NMR光谱。1D NMR方法广泛用于结构分析，但由于信号重叠，在解析复杂大分子结构时存在局限性[10]。2D NMR通过将信号分布在两个频率维度上，有效分离了1D光谱中的重叠信号，从而提高了复杂材料结构的NMR分辨率[11]。研究人员开发了多种2D液态NMR技术，包括相关光谱（COSY）、总相关光谱（TOCSY）、核奥弗豪泽效应光谱（NOESY）、异核单量子相干（HSQC）、异核多键相关（HMBC）、扩散有序光谱（DOSY）和2D J-分辨光谱（2D J-Res）[12]。2D HSQC NMR在¹³C维度上具有高信号分散性和窄线宽，显著减少了峰重叠，提高了光谱分辨率，并且得益于高效的¹H–¹³C极化转移，使得¹H能够检测到与¹³C相关的信号，尤其是在天然¹³C丰度较高的情况下显著提高了灵敏度[13]。凭借这些优势，该技术已广泛应用于天然复杂大分子（如整个植物细胞壁[14]、木质素[15]和半纤维素[16]）的结构解析。然而，由于2D HSQC NMR需要在间接维度上进行全采样，因此需要较长的扫描时间才能获得足够的信噪比（SNR）[17]，这给半纤维素的实时结构分析和高通量表征带来了不便。因此，迫切需要开发一种快速准确的2D HSQC NMR方法来表征烟草半纤维素的结构。

为了减少2D HSQC NMR的采集时间，已经开发了几种快速NMR表征技术，包括非均匀采样（NUS）[18]、超快二维NMR（UF 2D NMR）[19]和动态核极化（DNP）增强[19]。其中，NUS的应用最为广泛[20]。NUS放弃了传统的均匀采样（US）连续时间间隔采样模式，而是在时间域的不连续时间间隔内收集部分自由感应衰减（FID）数据点，从而在较短的时间内完成关键数据的记录[21]。由于NUS仅采集部分时间域数据点，因此需要数学算法来重建缺失的FID数据点，随后通过傅里叶变换获得干净的、无伪影的频域NMR光谱[22]。常见的重建算法包括多维分解（MDD）、最大熵（ME）和压缩感知（CS）[23]。在各种算法中，CS被认为是最有效的方法，可以基于较少的时间域数据点高效重建NUS NMR光谱数据[23]。目前，NUS/2D HSQC NMR方法显著缩短了分析时间，同时确保了蛋白质大分子[24]和代谢组小分子[25]等物质的定性和定量结构表征的准确性。然而，据我们所知，NUS主要应用于小分子研究，其在植物大分子多糖系统（如烟草半纤维素）中的应用较少。因此，期望通过将NUS/2D HSQC NMR应用于烟草半纤维素的结构表征来实现高通量结构分析。

为了有效破坏木质纤维素（LCC）的稳定结构并促进半纤维素的分离，必须选择合适的化学溶剂[26][27]。研究人员通常使用氢氧化钠[28]和二甲基亚砜[29]等传统溶剂进行半纤维素提取，但这些方法存在环境污染等问题。烟草具有复杂的成分体系，且半纤维素在其干重中的比例较低，使用传统溶剂时提取效率较低。因此，需要根据半纤维素的特性开发绿色高效的提取方法。深共晶溶剂（DESs）是由氢键受体（HBA）和氢键供体（HBD）通过氢键相互作用形成的绿色溶剂，近年来在生物质预处理领域受到了广泛关注[30]。DESs因其制备简单、成本低廉、溶解性好和可生物降解等优点，被视为传统溶剂的理想替代品[31]。研究表明，DESs可以有效地裂解LCC结构中的酯键和醚键，实现半纤维素的温和分离，并在半纤维素的选择性提取方面表现出优异性能[32][33]。根据pH值，DESs可分为碱性、中性和酸性类型，不同酸碱性质的DESs在半纤维素提取效率上存在显著差异[34][35]。研究不同酸碱性质的DESs预处理方法对烟草半纤维素提取的影响，并优化最佳溶剂类型，将为烟草半纤维素的结构分析奠定重要基础。

以烟草茎半纤维素为研究对象，通过优化NUS/2D HSQC NMR的采样比例，建立了一种快速的二维溶液态NMR表征方法，实现了半纤维素单糖单元的快速表征和准确定量。结合优化的DES提取方法，该方法进一步揭示了不同烟草部位半纤维素的结构差异，为烟草半纤维素的高价值利用提供了重要的方法支持。

材料与试剂

实验材料包括来自中国安徽省阜阳市的烟草茎（C3F）；以及来自中国四川省凉山的云烟87品种的烟草叶片（B2F、C3F、X2F）、茎（B2F、C3F、X2F）、秆和根。所有样品在60°C下干燥48小时，然后粉碎、研磨并通过40目筛子筛选。使用甲苯/乙醇（2:1，v/v）在索氏提取器中脱脂8小时，随后在通风橱中过夜存放，再在烤箱中干燥24小时。

提取方法的优化

半纤维素的提取产率、去除率和结构受到不同酸碱性质DESs的显著影响[34][35]。分别使用第2.2节制备的碱性DES C-M、中性DES C-G和酸性DES C-F从烟草茎中提取半纤维素。通过比较三种DESs的提取产率、烟草茎半纤维素的去除率以及2D HSQC NMR的表征结果，确定了最合适的DES类型。

结论

本研究通过优化NUS的采样比例参数，建立了一种高效的2D HSQC NMR方法用于表征烟草半纤维素。结合优化的DES提取方法，实现了烟草半纤维素结构和单糖含量分布的快速分析。结果表明，NUS/2D HSQC NMR的最佳采样比例为25%，在该比例下获得的光谱分辨率高于传统2D HSQC NMR得到的光谱。

作者贡献声明

Lijun Zhu：验证、研究、数据管理。 Ming Ma：验证、研究、数据管理。 Changguo Wang：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学、概念构建。 Jinfeng Wu：验证、研究、数据管理。 Along Zhou：撰写 – 初稿撰写、验证、方法学、数据分析、概念构建。 Shaolin Ge：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理。 Jun Yang：撰写 – 审稿与编辑、监督。

未引用参考文献

[46]。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢安徽省科技创新平台重点项目（项目编号：S202305a12020030）和中国烟草总公司（项目编号：110202502006）的财政支持。