《Computational Biology and Chemistry》：Integrating Bioinformatics, Machine Learning and Molecular Biology to Elucidate the Anti-Allergic Mechanisms of Ginkgo biloba Leaves
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过敏性疾病中IgE介导的肥大细胞和嗜酸性粒细胞反应的关键基因与信号通路及其与银杏叶提取物的作用机制研究。通过GSE96696数据库分析发现NF-κB和PI3K-AKT通路相关基因，RNA测序验证后证实GBL黄酮类成分通过抑制Rel和AKT1靶点减少炎症介质释放和钙离子内流。
作者：岳仁、吴敏轩、刘凯阳、张凌鹤、张彦玲、秦文
北京城市大学生物医学学院，中国北京100094
摘要
过敏性疾病，包括过敏性哮喘、特应性皮炎和食物过敏，已成为全球重大的公共卫生挑战。IgE刺激的肥大细胞和嗜碱性粒细胞在疾病发病机制中起着关键作用。我们之前的研究表明，银杏叶（GBL）提取物对IgE介导的肥大细胞脱颗粒具有潜在的治疗效果。本研究旨在确定与IgE介导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞反应相关的关键基因和通路，并探讨GBL成分的作用机制。首先，使用差异基因表达（DEGs）和加权基因共表达网络分析（WGCNA）在GSE96696数据集中初步识别与IgE刺激相关的候选基因。随后，在抗DNP IgE诱导的RBL-2H3脱颗粒模型上进行转录组分析，以验证关键基因，包括Egr1、Tnfaip3、Nfkbid、Il13、Nfkbia、Il3、Il4、Ccl7、Cdkn1a、Csf2、Rel，以及NF-κB和PI3K-AKT等关键信号通路。然后应用机器学习算法来确认这些关键基因的预测能力。基于这些发现，分子生物学实验、分子对接和分子动力学模拟表明，GBL中的黄酮类化合物（如槲皮素、阿mentoflavone、ginkgetin和bilobetin）通过靶向RELA和AKT1显著抑制细胞因子的释放、阻止钙离子内流并抑制脱颗粒。总体而言，我们的发现不仅确定了IgE介导反应的关键基因，还提供了关于GBL作用机制的初步见解。
引言
过敏性疾病，包括过敏性哮喘、特应性皮炎和食物过敏等，已成为日益严重的全球健康问题（Kim等人，2015年）。特应性进程的现象引起了人们对过敏性疾病发生和进展的广泛关注。通常，儿童最初表现为特应性皮炎，随后发展为食物过敏，并出现哮喘和鼻炎等呼吸道过敏症状（Hill和Spergel，2018年；Lowe等人，2018年；Spergel，2010年）。流行病学调查显示，发达国家和发展中国家中哮喘、鼻炎、结膜炎、荨麻疹、特应性皮炎和食物过敏的发病率都在上升（Cruz等人，2023年）。这一趋势表明过敏性疾病已转变为一个具有重大经济和社会影响的全球性健康问题（Lowe等人，2018年；Simon，2018年）。
过敏性疾病是由遗传倾向与环境触发因素之间的复杂相互作用引起的，涉及多种细胞、细胞因子、趋化因子和特定抗体。嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞在过敏性疾病的发生机制中起着核心作用。它们通过释放预先形成的和新合成的介质、颗粒蛋白和细胞因子来发挥其作用（Andersson等人，2016年；North等人，2012年）。此外，这些疾病的一个特征是对环境过敏原的过度免疫反应，常伴有特定免疫球蛋白E（IgE）的产生（Verschoor和von Gunten，2019年）。早期反应涉及过敏原特异性IgE分子与细胞表面受体FcεRI的交联，最终导致细胞脱颗粒。这一过程导致预先形成的颗粒介质（如组胺）以及脂质衍生物介质的释放（Puri和Roche，2008年）。后期反应以细胞因子的产生和释放为特征，招募嗜酸性粒细胞等炎症细胞到受影响组织，引发一系列炎症反应。目前对这些细胞在过敏和炎症中的生物学贡献的理解主要来自对释放介质的研究。然而，迫切需要进一步探索蛋白质和基因水平上的功能和特性。
银杏叶（GBL）在中国被广泛用作药用原料，以其血管扩张、调节脂质、拮抗血小板活化因子、保护缺血、抗炎和抗肿瘤的特性而闻名（Yip等人，2021年）。这些提取物已被证明对治疗冠心病、脑血栓形成、脑缺血、脑功能障碍、头部损伤后遗症和神经系统疾病有效，同时还能清除氧自由基。因此，它们在制药、健康补充剂和化妆品行业得到广泛应用。我们之前的研究揭示了GBL对支气管哮喘等过敏性疾病的治疗潜力。鉴于过敏性疾病的高发率和严重影响，以及GBL在抗过敏治疗中的潜在价值，本研究旨在确定与IgE介导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞反应相关的关键基因和通路，并初步探讨GBL的作用机制。
实验工作流程总结见图1和表1。首先，使用差异基因表达分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）分析GEO数据集GSE96696，以识别差异表达基因（DEGs）和共表达模块。对交集基因进行GO和KEGG富集分析，然后构建PPI网络，筛选可能与IgE介导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞反应相关的基因。其次，构建抗DNP-IgE诱导的RBL-2H3脱颗粒模型，并进行RNA-seq分析以验证关键基因。进一步使用机器学习方法验证这些基因。最后，利用分子生物学、分子对接和分子动力学技术探讨GBL成分对IgE介导反应的影响和机制。
化学品和试剂
RBL-2H3细胞购自上海泽业生物科技有限公司。抗DNP-IgE和二硝基苯偶联的牛血清白蛋白（DNP-BSA）购自Sigma公司。P-硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖苷溶液（PNAG）和柠檬酸购自Macklin公司。Na?CO?、NaHCO?和三碱式柠檬酸钠购自北京拜耳迪生物科技有限公司。PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq II）购自TAKARA公司。
差异基因表达（DEGs）的识别
基于limma分析，本研究系统地识别了GSE96696数据集中IgE刺激组和未刺激组之间的差异基因（DEGs）。FDR < 0.05且FC大于1.5的基因被认为是显著差异表达的。共识别出1,121个显著DEGs（见补充表1和图2A），其中包括642个上调基因和479个下调基因。此外，热图分析（图2B）显示了DEGs在不同组之间的表达差异。
讨论
过敏性疾病已成为重大的全球公共卫生挑战，其分子机制复杂（Camelo-Nunes和Solé，2010年；Ebert和Pillsbury，2011年）。肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞在驱动过敏反应中起着关键作用。本研究结合了生物信息学、机器学习、转录组学和分子生物学方法，确定了与IgE介导反应相关的关键基因和信号通路。此外，我们的发现还提供了初步的机制见解，表明GBL中的黄酮类化合物和双黄酮类化合物可能通过结合关键蛋白来调节IgE介导的反应。
结论
通过整合生物信息学、机器学习、转录组学和分子生物学技术，本研究系统地确定了与IgE介导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞反应相关的候选基因（Egr1、Tnfaip3、Nfkbid、Il13、Nfkbia、Il3、Il4、Ccl7、Cdkn1a、Csf2、Rel）和信号通路（NF-κB、PI3K-AKT）。我们的发现还提供了初步的机制见解，表明GBL中的黄酮类化合物和双黄酮类化合物可能通过结合关键蛋白来调节IgE介导的反应。
CRediT作者贡献声明
张彦玲：撰写——审稿与编辑，资金获取。
张凌鹤：撰写——初稿，资金获取。
刘凯阳：验证，正式分析。
吴敏轩：验证，研究。
岳仁：撰写——初稿，数据管理，概念构思。
秦文：监督，项目管理。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了北京城市大学航海基金（KYQH202436）的支持，以及北京城市大学2026年和2025年的“大学生创新创业培训计划（202511418019）”和国家自然科学基金（项目编号82073996）的支持。
