综述：体内兼容的邻近标记技术

《Current Opinion in Chemical Biology》：In vivo-compatible proximity labeling technologies

近场标记（PL）技术通过融合酶与目标蛋白，利用活性中间体标记邻近生物分子，结合质谱或测序解析空间分布。传统PL方法（如过氧化酶、生物素连接酶和光催化系统）因需外源试剂或存在背景干扰，难以直接应用于活体系统。近年研究聚焦开发体内兼容性PL技术，包括酪氨酸酶（TyroID）、漆酶和硫解酶等新型标记酶，以及近红外光、超声波和生物发光激活的光催化策略。这些进展为活体空间多组学（从亚细胞到器官水平）提供动态、高分辨的分子互作图谱，推动疾病机制和疗法开发研究。

　　

郭红阳|秦伟

清华大学药学院，北京，100084，中国

邻近标记（Proximity labeling，简称PL）已成为一种强大的技术，用于绘制亚细胞组成和分子相互作用图谱。该方法利用具有广泛底物特异性的酶生成活性物质来标记内源性生物分子，随后通过质谱或测序技术进行鉴定。然而，传统的PL方法（如过氧化物酶、生物素连接酶和光催化系统）在体内应用方面存在显著限制，这阻碍了它们在天然生物环境中的使用。在这篇综述中，我们首先总结了过氧化物酶和生物素连接酶在活体动物中的应用，强调了尽管存在这些限制，它们仍如何为细胞表面蛋白质组研究和细胞类型特异性分泌提供了重要见解。接着，我们探讨了与体内环境兼容的PL技术的最新进展，包括新型酶（如酪氨酸酶、漆酶和硫辛酸连接酶），以及由近红外光、超声波或生物发光激活的创新光催化策略。这些新兴工具具有将空间多组学研究从细胞系统扩展到整个生物体的巨大潜力。

引言

空间组学已成为解码活体系统中生理和病理过程的关键学科，它利用了哺乳动物细胞区室化和相互作用的重要机制[1]。通过将荧光成像与测序技术结合，这些方法能够在不同尺度上绘制生物分子的分布图，提供了静态或体外模型无法复制的全面视图[2]。体内空间组学的优势在于其能够捕捉细胞与其天然组织微环境之间的动态、实时相互作用——从系统级的器官水平交流到短暂的亚细胞微域。保持这种生物学背景对于理解复杂系统作为一个整体至关重要，最终有助于我们更深入地了解发育、疾病进展和治疗反应在其最相关和功能性的环境中是如何发生的。

在这些技术中，邻近标记（PL）成为了一种强大的方法，它结合了显微镜技术和质谱/测序技术的优势，能够以高时空分辨率无偏地分析内源性生物分子[3]。PL涉及将一种具有广泛底物特异性的酶（例如工程改造的过氧化物酶[4]或生物素连接酶[5]）与目标蛋白或特定细胞器靶向序列进行基因融合（图1a）。激活后，这些酶会生成短寿命的活性物质，标记周围1-10纳米范围内的内源性生物分子。需要注意的是，这个标记半径并不是一个严格的界限，而更像是一个“梯度”——活性物质的浓度以及标记效率随着距离酶活性位点的增加而降低。底物探针通常被修饰上生物素或生物正交基团，从而便于后续对标记蛋白的富集和鉴定。在过去十年中，PL已被广泛用于绘制特定亚细胞区域的分子组成并揭示蛋白质-蛋白质相互作用[6,7]。

三种主要的PL方法已在培养细胞中得到广泛应用：过氧化物酶、具有广泛底物特异性的生物素连接酶和光催化系统（图1b）。过氧化物酶（如工程改造的抗坏血酸过氧化物酶APEX2和辣根过氧化物酶HRP[8]）在短暂接触H₂O₂后会产生苯氧基自由基，主要标记酪氨酸残基上的蛋白质。具有广泛底物特异性的生物素连接酶（如BioID[9]和TurboID）利用ATP将生物素转化为生物素-AMP，进而标记邻近蛋白质上的赖氨酸残基。光催化PL系统包含基因编码的光敏剂和金属/小分子催化剂，在可见光照射下产生活性中间体以标记邻近蛋白质[10, 11, 12, 13]。

在这篇综述中，我们深入总结了这些成熟PL技术在体内的应用，批判性地分析了它们的潜力和局限性，并概述了这一快速发展的领域的未来方向。

部分摘录

成熟PL技术在体内的应用

尽管上述传统PL方法在细胞培养中非常有效，但在体内应用时存在显著限制（图1b）。过氧化物酶需要使用有毒的H₂O₂，而这种试剂不能直接用于活体动物。具有广泛底物特异性的生物素连接酶依赖于外源性的生物素，但许多组织中内源性生物素的高浓度会导致严重的背景标记，从而影响信噪比。此外，大多数光催化PL系统也存在类似问题。

新兴的体内兼容PL酶

为了克服这些限制，研究人员开发了几种体内兼容的PL酶。Hamachi和Qin实验室开发了基于酪氨酸酶的PL方法（例如TyroID），该方法仅需要氧气即可催化酚类底物生成醌中间体，这些底物也是APEX2标记所使用的[27,28]（图3a）。由于无需使用有毒的H₂O₂，TyroID已成功应用于小鼠模型中的体内PL实验，包括肿瘤异种移植和海马组织。

用于体内应用的光催化PL的发展

早期的光催化PL方法（如单线态氧生成器和μMAP）主要依赖可见光（通常是蓝光）进行激活。为了解决可见光在组织中的穿透深度有限的问题，我们开发了Silicon-rhodamine-enabled Identification（SeeID），这是一种近红外光控制的PL系统，它弥补了成像和PL之间的差距[38]（图4a）。SiR的荧光特性进一步确保了标记的特异性，因为只有在与特定蛋白结合后才会变得具有催化活性。

结论与展望

在过去十年中，PL已成为绘制培养细胞中空间信息的强大工具，提供了传统蛋白质组学无法获得的见解。尽管PL具有广泛的应用价值，但仍迫切需要将其扩展到体内应用。然而，三种主要的PL方法（过氧化物酶、生物素连接酶和光催化系统）在活体动物中存在显著限制，这阻碍了在生理和病理背景下的发现。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号92478128和22477066，资助人W.Q.）、国家重点研发计划（编号2024YFA1308000，资助人W.Q.）、北京市自然科学基金（编号JQ25018，资助人W.Q.）、清华大学青年人才培养基金（资助人W.Q.）、清华大学“博士生支持计划（资助人W.Q.）、北京生物结构前沿研究中心以及北京国家分子科学实验室的基础研究资金的支持。