综述：基于CRISPR的电化学发光生物传感器：原理、优化策略及转化应用挑战——近期进展综述

《Food Chemistry: Molecular Sciences》：CRISPR-based electrochemiluminescence biosensors: Principles, optimization strategies, and translational challenges – A review of recent progress

　　尹晓云|范泽|童朝阳
国家关键实验室（NBC危害防护化学），北京102205，中国

**摘要**
CRISPR/Cas系统与电化学发光（ECL）的结合已成为构建高性能生物传感平台的一种有前景的策略。CRISPR系统，特别是Cas12a和Cas13a，能够程序化地识别核酸目标并激活转切割活性。ECL提供了低背景和宽动态范围的灵敏信号输出。作为一篇综述文章，本文全面概述了CRISPR-ECL生物传感器的最新进展，重点介绍了优化策略和实际应用。首先讨论了与生物传感相关的Cas12a和Cas13a的工作原理，强调了它们的独特动力学特性、crRNA设计考虑因素以及反应条件要求。然后从三个相互关联的层面探讨了优化方法：核酸探针设计（信号开启、信号关闭和辅助探针）、传感界面工程（探针结构、发光剂、电极材料和磁性纳米材料）以及级联信号放大（PCR、CHA、RCA、SDA、EDA和RPA）。通过跨研究比较，我们评估了不同方法的优点和局限性，并指出了关键的知识空白。文章总结了这些传感器在检测疾病生物标志物、病原体核酸、环境污染物和酶活性方面的应用。尽管取得了显著的灵敏度，但在检测时间、复杂基质中的重复性以及临床验证方面仍存在挑战。从工业化和全球健康的角度出发，还讨论了监管批准、制造可扩展性、成本控制以及在资源匮乏环境中的部署问题。最后，提出了简化工作流程、提高基质鲁棒性、标准化验证、多重检测和适用于即时检测平台的未来发展方向。这篇综述为从事CRISPR-ECL生物传感及相关领域的研究人员提供了结构化的参考和关键视角。

**1. 引言**
CRISPR/Cas系统与电化学发光（ECL）的结合已成为构建高性能生物传感平台的一种有前景的策略。CRISPR系统，特别是Cas12a和Cas13a，能够程序化地识别核酸目标并激活转切割活性（Eisenstein, 2022）。ECL提供了低背景和宽动态范围的灵敏信号输出，使得检测性能难以仅通过基于荧光的方法实现。目前的CRISPR基诊断方法主要依赖于荧光报告，虽然简单且灵敏，但在复杂样本中面临挑战。自荧光干扰、光散射以及对精确光学仪器的需求可能限制定量准确性和即时检测的可行性（Masi et al., 2023; Wei, Wang, She, & Fu, 2025）。这些局限性促使人们探索替代的信号转导机制。ECL技术通过在电极表面进行电化学反应产生光，从而避免了光漂白和背景散射等问题。它具有低背景信号、高信噪比以及与微型化仪器的兼容性（Xin, Su, Cui, Wang, & Song, 2025）。这些特性使得ECL特别适合将CRISPR识别事件转化为稳健的分析信号。CRISPR的特异性与ECL的灵敏度的结合吸引了大量研究兴趣，导致了许多研究探索优化策略，包括探针设计、发光剂开发、电极工程和信号放大。这些研究产生了能够检测多种目标的传感器，包括疾病生物标志物、病原体核酸、环境污染物和酶活性。

CRISPR-ECL领域发展迅速，产生了多种优化策略和应用。然而，缺乏一个综合性的综合研究来整合各研究的发现并评估它们的相对优势。个别研究往往专注于传感器开发的特定方面，使得难以评估不同方法的比较效果。此外，将这些传感器从实验室研究转化为实际应用时面临普遍存在的挑战，但这些挑战尚未得到系统性的研究。因此，需要一篇综合性的综述来整合该领域的研究成果，巩固现有知识，识别新兴趋势，并确定研究空白。本文通过广泛检索近年来（2020–2026年）在主要科学数据库（Web of Science、PubMed、Scopus）上发表的文献，总结了CRISPR-ECL生物传感器的研究和开发进展。首先讨论了与生物传感应用相关的Cas12a和Cas13a的操作原理，强调了它们的独特动力学特性和设计考虑因素。然后从三个相互关联的层面探讨和比较了优化方法：核酸探针设计、传感界面工程和级联信号放大。通过跨研究比较，我们评估了不同方法的优点和局限性，并指出了关键的知识空白。随后，我们总结了在主要目标类别中的应用情况，关注了验证状态和实际障碍。最后，我们指出了剩余的挑战，并讨论了向简化、稳健和适用于即时检测平台的未来发展方向。这篇综述旨在为研究人员提供结构化的参考和关键视角，以推动这一快速发展的领域的进一步创新。

**2. CRISPR/Cas系统的机制**
CRISPR/Cas系统是一种广泛存在于古菌中的适应性免疫机制，其核心功能在于识别和降解入侵病毒和其他外来遗传物质（Jiang et al., 2025）。该系统通过将外来核酸片段整合到宿主基因组的CRISPR阵列中，形成可遗传的免疫记忆。当宿主再次遇到同源的外来核酸入侵时，从CRISPR阵列转录的crRNA可以引导Cas效应蛋白精确识别并切割特定目标序列，从而实现入侵遗传元素的特异性清除（Nussenzweig & Marraffini, 2020; Pacesa, Pelea, & Jinek, 2024）。根据Cas蛋白组成、作用机制和CRISPR结构的差异，CRISPR/Cas系统可分为两大类：I类（Type I、III和IV）系统依赖于多个Cas蛋白组装成效应复合体来执行功能，而II类（Type II、V和VI）系统仅需要一个效应蛋白即可完成核酸切割。广泛使用的Cas9（Type II）、Cas12（Type V）和Cas13（Type VI）都属于II类系统（Li et al., 2023; Makarova et al., 2025）。

作为CRISPR/Cas系统的核心功能蛋白，Cas蛋白的检测特性取决于目标识别的特异性和核酸切割活性的多样性。大多数Cas蛋白需要crRNA与目标核酸形成碱基互补性以实现靶向识别，而某些Cas蛋白（如Cas9和Cas12）还需要识别目标核酸上的特定原间隔序列（PAM），进一步提高靶向特异性。同时，不同的Cas蛋白在切割底物类型和切割模式上也存在差异。此外，一些Cas蛋白在切割目标核酸后还会激活非特异性的转切割活性。这一特性在核酸检测领域得到了广泛应用，通过检测转切割活性实现了目标核酸的定性或定量分析。

在各种Cas蛋白中，Cas12a和Cas13a因其独特的转切割功能特性而受到广泛关注（表S1）。Cas12a蛋白属于V类CRISPR/Cas系统。其核心特性是能够靶向并切割DNA。在识别并切割目标DNA后，它会激活针对单链DNA（ssDNA）的非特异性转切割活性。在识别双链DNA（dsDNA）目标时，该蛋白需要一个富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列。它切割目标dsDNA，在目标位置产生平末端或粘末端。激活的转切割活性可以非特异性地降解系统中存在的任何ssDNA分子。目前，Cas12a蛋白已应用于病原微生物DNA检测和基因突变检测等场景。

从实际检测特性的角度来看，Cas12a的整体激活动力学相对较慢，周转数较低，导致信号增加较为缓慢（Nalefski et al., 2021）。通常需要与预扩增结合使用以提高灵敏度。同时，Cas12a对缓冲液pH值和盐浓度等反应条件较为敏感。crRNA设计必须严格满足5′-TTTV PAM要求，间隔长度约为20 nt。种子区域集中在PAM末端附近，要求与目标序列具有高互补性。

Cas13a蛋白属于VI类CRISPR/Cas系统。与Cas12a的主要区别在于其靶向底物是单链RNA（ssRNA），并且不需要PAM序列进行识别。在切割目标ssRNA后，Cas13a同样会激活非特异性转切割活性；然而，这种活性仅作用于ssRNA分子，不作用于ssDNA。在切割目标ssRNA时，它会在目标序列内部产生切割位点，同时激活的转切割活性可以降解系统中存在的其他非特异性ssRNA。这一特性使其特别适用于涉及ssRNA目标的检测场景，如RNA病毒检测和基因表达水平分析（Zilberzwige-Tal et al., 2025）。

在实际检测性能方面，Cas13a具有更快的激活动力学和更高的周转数，能够实现快速且灵敏的信号放大。它对温度和缓冲液盐条件的变化具有更好的兼容性。其crRNA不需要考虑PAM序列，只需与目标RNA互补，间隔长度通常在20到28 nt之间。5′种子区域对错配非常敏感，使其更适合快速、高灵敏度的RNA目标筛选（Villiger et al., 2024）。

利用其对特定核酸序列的高特异性识别能力和转切割活性，CRISPR/Cas系统为生物传感分析提供了强大的分子识别工具（Dai, Wu, Liu, & Gooding, 2020; Li et al., 2025）。同时，ECL技术通过电化学过程激发光信号，将分析物的化学信息转化为可检测的光信号，具有低背景和高灵敏度等显著优势（Lee, Lee, Ji, Lee, & Hong, 2021）。在此基础上，将CRISPR系统的精确分子识别与ECL的灵敏信号输出相结合，实现了新一代生物传感平台的构建，这些平台结合了高特异性和超高灵敏度，从而实现了目标的高效准确检测。

**3. CRISPR-ECL传感的性能优化策略**
CRISPR-ECL生物传感器的性能在很大程度上取决于信噪比以及将CRISPR识别和切割事件转化为ECL信号的效率。根据信号转导过程中各组件的作用，构建策略主要围绕三个层面：首先是信号转导机制和探针的设计，这是传感器运行的基础；其次是优化传感界面中的关键组件以提高界面反应效率和信号强度；最后是通过整合核酸扩增技术引入级联信号放大策略，以实现微量目标的超灵敏检测。CRISPR-ECL生物传感器的优化策略在附图（图1）中进行了说明。（见表1、表2、表3。）

**图1. CRISPR-ECL优化策略。**
**表1. 探针类型比较。**
| 探针类型 | 信号变化 | 优点 | 缺点 | 典型应用场景 | 参考文献 |
|--------|--------|------|---------|---------|CRISPR-ECL生物传感器中常用的荧光团及其共反应物

| 材料名称 | 共反应物 | 优点 | 局限性 | 参考文献 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| [Ru(bpy)?]2? | TPr | 信号稳定，背景低，可重复使用 | Zhang, Wu, et al., 2025 |
| Ru(phen)?2? | TPr | 结合DNA沟槽 | 环境敏感的发光 | Liu et al., 2025 |
| [Ru(phen)?dppz]2? | TPr | 增强DNA信号，电极修饰少 | Zhou et al., 2020a, Zhou et al., 2020b |
| Luminol | H?O? | 水溶性高，背景低 | 发光寿命短 | Liu et al., 2024 |
| Ir(dmpq)?(acac) | TPr | 抗光漂白，量子产率高，发射可调 | Xu, Ma, Dai, Mao, & Zhou, 2024 |
| AgNCs | K?S?O? | 生物相容性好，信号稳定 | 合成敏感性高，易聚集 | Zhao et al., 2023 |
| Met-AuNCs | TEA | 生物相容性好，成本低，背景低 | ECL强度低 | Liu et al., 2021 |
| PFBT NPs | – | 信号强/稳定，易于功能化 | Cu2?会淬灭，需要特定淬灭剂 | Xie, Yang, Yuan, Tan, & Chen, 2024 |
| CsPbBr?@PDA-AuTPr | A | ECL效率高 | 存储过程中ECL衰减 | Luo et al., 2026 |
| N-CDs | K?S?O? | 制备简单，性能稳定，生物相容性好 | 需要外源性S?O?2? | Wang et al., 2025 |
| Ni??-Nv-CNO? | – | 毒性低，效率高 | 导电性差，电极钝化 | Li et al., 2025 |
| BPTP-AgNCs | Assy | K?S?O? | 提高ECL活性/稳定性 | 形态变化大，合成复杂 | Wu et al., 2024 |
| g-C?N? NSs | K?S?O? | 与AuPd、AuS有协同作用 | 内在信号弱，受环境影响 | Wang et al., 2021 |
| PTCA-COF | K?S?O? | 结构有序，信号稳定 | 合成严格，易聚集 | Li et al., 2022 |
| CD-COF | K?S?O? + Bu?NP | 效率高/稳定，分散性好 | 导电性差，电子传输受阻 | Ma et al., 2023 |
| PFN NPs | – | 触发电位低，信号强，背景低 | 需要阶梯脉冲模式，分散波动 | Jing, Li, Zhao, Yuan, & Chen, 2024 |
| Alq? MCs | TPr | 晶化增强ECL，成本低 | 单体效率低 | Peng et al., 2023 |
| TEA-Pdots | – | 无共反应物，NIR发射减少背景 | 发射波长固定，合成要求高 | Xu, Deng, Liu, & Zhou, 2025 |
| C?N? QDs@C?N? NFs | K?S?O? | 稳定性高，生物相容性好 | 合成繁琐，耗时 | Zhang et al., 2025 |
| PdCuBP@luminolO? | Luminol增强，生物相容性好 | 易氧化，效率下降 | Liu et al., 2022 |
| PCN-224 | K?S?O? | 信号强，与SH-DNA结合牢固 | 合成控制严格 | Liu et al., 2023 |
| CPDs@SiO? | K?S?O? | 效率高/稳定，背景低 | 单独使用CPDs效率低 | Gao et al., 2023 |
| PFODBT@MSX | K?S?O? | 信号稳定 | 合成复杂 | Li et al., 2024 |
| TCPP-Fe@HMUiO@Au-ABEI | H?O? | 表面积/催化能力强，信号放大 | 复杂的多步骤制备 | Shen et al., 2023 |
| Ir-ZIF-8 | TEA | ECL，结构稳定 | 加载控制关键，效率受距离影响 | Shi, Jia, et al., 2024 |
| L-Cys@Fe?O? MNPs | TPr | 磁分离减少干扰 | 低浓度响应弱 | Zhao et al., 2022 |
| Ru@SiO? | TPr | 稳定性好，介孔传输，信号稳定 | 需要精确合成，外壳可能阻碍接触 | Li et al., 2025 |
| Y-BTCK?S?O? | 效率高，稳定性好，生物相容性好 | 需要预还原 | Hu et al., 2025 |
| Au?g?C3N4 | K?S?O? | 信号稳定，生物相容性好 | 纯g-C?N?导电性差 | Zhang, Fan, Ding, & Xie, 2022 |
| Au@PEI-ABEI@PtH?O? | 表面积大，生物相容性好 | 对温度/pH敏感，储存要求严格 | Wang et al., 2024 |
| C-CN/PCNv | K?S?O? | 抗钝化，信号放大 | 复杂的多步骤制备 | Li et al., 2024 |
| GOAu–Ru | TEA | 生物相容性好，效率高，易于生物偶联 | 多步骤修饰，稳定性受参数影响 | Zhang et al., 2022 |
| ILu/HOF-14 | H?O? | 信号强，稳定性增强 | 纯ILu效率低 | Lu, Huang, Wang, Li, & Liu, 2023 |
| ZIF-8@Pe | K?S?O? | 活性增强，稳定性好 | 封装控制困难，溶解风险 | Li et al., 2024 |
| Au@CNDs | – | 效率高，生物相容性好，背景低 | 产量受参数影响 | Hang, Zhao, Wang, Liu, & Wang, 2022 |
| Ru-PEI-L-lys-ZIF-8 | TPr | ECL性能好 | 有静电排斥风险 | Lin et al., 2023 |
| AuNPs@CoFe-PBAH?O? | 催化能力强，Luminol增强 | 空间阻碍抑制 | Zhang et al., 2024 |
| P-AlOG@AuPt | K?S?O? | 副反应少，效率高，毒性低，生物相容性好 | 水中膨胀 | Song et al., 2026 |
| NiCo?O? NCs@Au-ABEIH?O? | 催化能力强，直接修饰AuS | 纳米粒子聚集 | Zhang et al., 2024 |

表3. CRISPR-ECL生物传感器的应用

| 应用领域 | 检测目标 | 检测样本 | 检测性能 | 放大方法 | 参考文献 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 疾病生物标志物检测 | miRNA-17 | 细胞裂解液 | 1 fM | EXPAR | Zhou, Huang, Huang, Shen, Shan, & Xing, 2020 |
| miRNA-21 | 尿液样本 | 0.53 fM | HCR | Xu et al., 2023 |
| miRNA-31 | 血清样本 | 1.67 aMSDA | Ji et al., 2026 |
| miRNA-132 | 血清样本 | 147 aMSDA | Xie et al., 2024 |
| miRNA-141 | 生物样本 | 3.3 fM | HCR | Wang et al., 2022 |
| miRNA-145 | 细胞裂解液 | 0.41 fM | Li et al., 2024 |
| miRNA-155 | 血清样本 | 1.27 aM | EXPAR | Gong et al., 2024 |
| miRNA-320d | 血清样本 | 0.342 fM | HCR | Zhang et al., 2025 |
| miRNA-543 | 血清样本 | 6.91 fM | Li et al., 2025 |
| miRNA-622 | 血清样本 | 1.09 fM | HCR | Liu et al., 2024 |
| ts3011a RNA | 生物样本 | 3.33 fM | HCR | Wu et al., 2024 |
| miRNA34c-5p | 血浆样本 | 0.074 fg/mL | Hiniduma et al., 2025 |
| Fusobacterium nucleatum | 粪便样本 | 1 CFU/ml | Zhang et al. |
| COX III基因 | 尿液样本 | 0.18 pM | Liu et al., 2022 |
| m6A | 细胞裂解液 | 0.05 pMSDA | Su et al., 2025 |
| NF-κB p50 | 细胞裂解液 | 0.235 fM | Li et al., 2024 |
| AMACR | 生物样本 | 1.25 ng/mL | Ling, Yi, Ling, Ying, & Jing, 2022 |
| MMP-2 | 血清样本 | 62.05 fM | Li et al., 2025 |
| RNA聚合酶 | 血清样本 | 7 | Li et al., 2025 |
| 病原体核酸检测 | HPV-16 DNA | 宫颈拭子样本 | 3.4 fM | Chen et al., 2023 |
| HPV-18 DNA | 血清样本 | 5.3 fM | Luo et al., 2024 |
| HBV DNA | 血清样本 | 7.41 fM | Luo et al., 2023 |
| HSV DNA | 临床样本 | 0.1 fM | HCR | Xu et al., 2025 |
| B. pseudomallei | 血清样本 | 5 CFU/mL | Wang et al., 2024 |
| P. aeruginosa | 细菌样本 | 73 fM | Xu et al., 2024 |
| E. coli 16S rRNA | 生物样本 | 0.372 fM | Mao et al., 2025 |
| Sa 16S rDNA | 血清样本 | 0.437 fMSDA | Liu et al., 2023 |
| 狂犬病病毒RNA | 脑脊液样本 | 2.8 pM | HCR | Liu et al., 2022 |
| SARS-CoV-2 RNA | 环境表面 | 0.67 fM | HCR | Yang et al., 2022 |
| 环境和食品安全检测 | BPA | 环境水样本 | 2.21 fM | Ma et al., 2023 |
| MC-LR | 环境水样本 | 0.015 pM | Zhao et al., 2023 |
| PFOA | 环境水样本 | 1.97 fM | RCA | Jing et al., 2024 |
| PQ | 血清样本 | 血清样本，湖水 | 0.7 pg/mL | CAH | Zhong et al., 2025 |
| Hg2? | 环境水样本，血清样本 | 0.45 fM | Hang et al., 2022 |
| NDMA | 干燥海产品 | 5.33 pg/mL | RCA | Zheng et al., 2025 |
| S. enteritidis | 食品样本 | 37 CFU/mL | Allosteric probe-triggered isothermal amplification | Wang et al., 2023 |
| 氯霉素 | 食品样本 | 7.75 pg/mL | HCR | Zhang et al., 2024 |
| 河豚毒素COI基因 | 混合肉样本 | 17.4 fg/μL | PCR | Zhang et al., 2024 |
| GM大豆SHZD32–1 | 大豆样本 | 0.3 fM | Ge et al., 2021 |
| 乙酰氨基吡啶 | 生菜样本 | 394 fM | RCA | Li, Y. Li, et al., 2024 |
| 17β-雌二醇 | 牛奶样本 | 0.27 fg/mL | HCR | Du et al., 2025 |
| AFB1 | 大米样本 | 0.044 pg/mL | HCR | Song et al., 2026 |
| GM玉米Mon810 | 混合玉米样本 | 3.3 fM | Zhu, Zhang, Pan, Zhang, & Dai, 2024 |
| 其他生物分子和酶活性检测 | LPS | 血清样本 | 0.24 pg/mL | Shi et al., 2024 |
| ATP | 血清样本 | 1.9 nM | Zhao et al., 2022 |
| Siglec-5蛋白 | 缓冲液 | 20.22 fM | HCR | Zhang et al., 2021 |
| PSA | 血清样本 | 4.5 × 10?? μg/mL | Yang et al., 2024 |
| AMACR | 标准样本 | 1.0 × 10?? μg/mL | Li, Liu, et al., 2023 |
| Dam MTase | 血清样本 | 23.4 mU/mL | Lin et al., 2023 |
| FEN1 | 细胞裂解液 | 0.003 mU | Li et al., 2023 |
| ALP | 细胞裂解液 | 1.61 U/L | HCR | Wang, Zhou, Wang, & Zhang, 2025 |
| Telomerase | 细胞裂解液 | 2.3 cells/mL | HCR | Zhang, Gao, et al., 2025 |
| α-Synuclein寡聚体 | 生物样本 | 1.025 aM | EXPAR | Gong et al., 2025 |
| APE1 | 2.06 × 10?11 U/μL | APA | Tao et al., 2025 |
| BNP | 血清样本 | 0.03 pg/mL | LEDA | Li, Lian, et al., 2025 |
| Argonaute2 | 细胞裂解液 | 0.145 aM | Gong et al., 2025 |
| 5hmC | 生物样本 | 0.89 fM | APA | Li, W. Liu et al., 2024 |
| 5mC | 血清样本 | 41.55 aM | APA | Gao et al., 2023 |
| FTO | 细胞裂解液 | 0.63 pM | Li et al., 2024 |
| COX III: 细胞色素c氧化酶亚基III; m6A: N6-甲基腺苷; AMACR: α-甲基酰基辅酶A消旋酶; Sa: 金黄色葡萄球菌; BPA: 双酚A; MC-LR: 微囊藻毒素-LR; PFOA: 全氟辛酸; PQ: 对羟基喹啉; NDMA: N-亚硝基二甲胺; SHZD32–1: 转基因大豆SHZD32–1; AFB1: 黄曲霉毒素B1; LPS: 脂多糖; ATP: 腺苷三磷酸; PSA: 前列腺特异性抗原; FEN1: 折翼内切酶1; ALP: 碱性磷酸酶; APE1: 阿purinic/Apyrimidinic内切酶1; BNP: 脑钠尿肽; 5hmC: 5-羟甲基胞嘧啶; 5mC: 5-甲基胞嘧啶; FTO: 脂肪质量和肥胖相关蛋白; EXPAR: 指数放大反应; HCR: 杂交链反应; SDA: 束链置换放大; CHA: 催化发夹组装; EDA: 熵驱动催化放大; APR: 自循环邻近记录 |

3.1. CRISPR-ECL生物传感器的构建策略和核酸探针设计
CRISPR系统的转切割活性在目标识别后被激活，作为CRISPR-ECL传感器的核心分子开关。这种活性通过切割特定的单链核酸探针来调节电极界面处的ECL信号。根据探针在信号转导中的作用，主要机制可以分为以下三种类型（图2）（表1）。
(1) 探针在其末端与ECL发射剂固定；转切割导致发光团释放，从而降低信号强度（Wang et al., 2023）。
(2) 在探针末端连接一个淬灭剂；切割会破坏其对电极表面上发射剂的抑制作用，导致信号开启（Shi et al., 2024）。
(3) 探针作为辅助序列；其完整状态有助于发光材料的结合，而切割会消除这一功能，从而调节ECL信号（Li, Yu, Wu, & Ju, 2023）。

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图2. 核酸探针的类型
(A) 探针末端连接到发光材料；
(B) 探针末端连接到淬灭材料；
(C) 辅助探针。

然而，这些基本设计在实际应用中存在局限性。信号关闭的探针虽然设计简单，但由于淬灭不完全或探针非特异性降解，常常导致背景较高，容易产生假阳性。信号开启的探针具有较低的背景和较高的灵敏度，但它们依赖于有效的切割，因此不完全激活可能导致假阴性。辅助探针提供了更大的设计灵活性，并能够实现逻辑门操作，但其复杂性需要仔细优化以确保可靠的性能。这些考虑表明，探针的选择必须根据目标应用的具体要求来指导，平衡灵敏度、特异性和操作简便性。

3.2. 传感界面的优化
传感界面的性能对于确定CRISPR-ECL生物传感器的分析性能至关重要。优化的目标是提高生物识别效率、放大ECL信号输出并减少背景噪声。这需要在多个维度上进行协同设计和优化，包括核酸探针的空间配置、发光材料的发光效率、电极界面的电荷转移特性以及磁性纳米材料的整合。

3.2.1. 核酸探针结构的优化
Cas蛋白的转切割活性是CRISPR-ECL系统中实现信号转导的关键机制，其效率和稳定性直接受到生物分子在传感界面上的固定和反应方式的影响。早期的方法通常涉及将单链核酸探针直接固定在电极表面上，利用Cas蛋白-crRNA复合物的特异性识别来触发转切割，从而调节ECL信号（Wang et al., 2023）。然而，这种固相界面策略存在显著的空间限制和分子排列无序的问题，限制了Cas蛋白的切割效率。此外，核酸探针在复杂的液体环境中容易发生非特异性吸附或降解，导致背景噪声高和稳定性差。
为了克服这些限制，已经开发了各种界面工程策略。Zhang等人（Zhang, Fan, Ding, & Xie, 2022）构建了一种三链DNA四面体纳米结构作为Cas12a的识别和切割平台。通过将四面体的侧边设计为特定的切割位点，这种刚性的三维支架可以精确控制探针的方向和表面密度，使切割位点完全暴露在溶液环境中（图3A）。与线性探针相比，这种结构控制显著提高了切割效率。然而，值得注意的是，这些纳米结构的组装更为复杂和耗时，可能不适合需要快速、即时检测的应用，因为简单性至关重要。

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图3. 核酸探针结构的优化
(A) 使用三链DNA四面体纳米结构进行检测的示意图（Zhang, Fan, Ding, & Xie, 2022）；
(B) 顶点连接淬灭分子的DNA四面体示意图（Zhang, Gao, Shi, Wu, & Miao, 2025）；
(C) 使用DNA发夹结构进行检测的示意图（Wang et al., 2021）。

在此基础上，Zhang等人（Zhang et al., 2025）通过修改双链DNA四面体的顶点并连接ssDNA淬灭分子进一步优化了结构（图3B）。这种设计不仅更有效地模拟了溶液中ssDNA的构象，减少了非特异性吸附，还调节了信号分子与电极之间的距离，优化了电子转移效率。
发夹结构提供了不同的信号转导方式。与线性单链相比，它们稳定的二级结构更有利于CRISPR/Cas系统的识别和切割。在Wang等人的工作中（Wang et al., 2021），设计的发夹报告序列在电极表面附近稳定了g-C3N4纳米片，显著增强了ECL信号。在目标miRNA-141存在的情况下，CRISPR/Cas12a的转切割活性通过3D DNA行走机制被激活。发夹的明确茎环区域为Cas12a提供了可访问且有序的切割底物，实现了超灵敏的检测，检测限为0.331 fM（图3C）。与刚性四面体支架相比，发夹探针依赖于动态构象变化，如果设计不当，这些变化可能会受到阻碍。这两种探针结构各有优势：四面体结构减少了空间阻碍并提高了探针的可访问性；发夹结构通过稳定的二级构象提供了更有序的切割底物。未来的发展可能会结合这两种策略，例如将发夹基序整合到四面体支架中，以实现协同效益。

3.2.2. ECL荧光团的优化
荧光团是CRISPR-ECL系统中信号生成的核心组件，将生物识别事件转化为可量化的光学信号。它们的ECL效率、稳定性和界面功能化直接决定了检测灵敏度和信噪比。
在ECL荧光团领域，Ru(bpy)?2?及其衍生物因其高发光效率、良好的水溶性和成熟的共反应物放大机制而成为经典标记物（Han et al., 2023）。然而，在固相修饰过程中，这些小分子容易泄漏和脱附。它们相对较大的分子尺寸和缺乏有效的靶向功能基团导致在电极表面的固定密度低和排列不良，限制了发光强度和传感器的可重复使用性（Kerr, Doeven, & Francis, 2022）。
为了克服这些限制，研究人员开发了新的固定策略。例如，Zhang等人（Zhang et al., 2025）构建了一种金纳米珊瑚结构的电极，显著增加了固定荧光团的活性位点。这种结构不仅提供了较大的表面积，还通过等离子体共振效应增强了界面电子转移，实现了低至1 fM的目标核酸检测限。
除了优化经典荧光团外，开发新型ECL材料也成为重要的研究方向。Liu等人（Liu et al., 2021）提出了L-甲硫氨酸稳定的金纳米簇（Met-AuNCs）作为新的ECL荧光团。这种材料具有与Ru(bpy)?2?相当的高ECL效率和良好的生物相容性。其超小的尺寸（<3纳米）和丰富的表面官能团使得能够在电极表面实现高密度的共价固定，有效避免了泄漏问题（图4A）。李等人（Li, Liu, Liang, Zhuo, & He, 2023）开发了具有高荧光量子产率和优异光稳定性的功能化聚合物点（Pdots），使其适合与生物识别元件结合使用（图4B）。下载：下载高分辨率图像（160KB）下载：下载全尺寸图像。图4. ECL发光体的优化：(A) L-甲硫氨酸稳定的金纳米簇（Met-AuNCs）的示意图（Liu et al., 2021）；(B) Pdots-DNA的示意图（Li et al., 2023）；(C) QDs@NFs复合材料的检测应用和合成示意图（Li, Yang, Yuan, Zhong, & Zhuo, 2022）。（关于该图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）张等人（Zhang, Zhang, et al., 2025）将C3N4量子点与C3N4纳米花复合，构建了一种异质结构的QDs@NFs复合材料。通过利用匹配的能级促进界面电荷分离，这种材料显著增强了ECL发射强度和稳定性。李等人（Li et al., 2022）将苝-3,4,9,10-四羧酸二酐（PTCDA）封装在共价有机框架（COF）的通道中。高度有序的多孔结构有效抑制了聚集并减少了由π-π堆叠引起的发光淬灭（图4C）。表2中总结的各种发光体显示了CRISPR-ECL传感器设计的明显演变。传统的分子发射体具有成熟的化学性质和高效率，但其实际应用常常受到渗漏问题和空间阻碍的限制。这促使人们对纳米材料（包括金属纳米簇、量子点和聚合物点）产生了更大的兴趣，因为它们提供了更大的表面积和更多的官能团以实现稳定的固定。然而，它们的合成通常更为复杂，批次间的重复性仍然是商业化应用的一个关注点。像COF或MOF封装的发光体这样的复合结构代表了一种新兴趋势，它结合了多孔框架的稳定性和分子发射体的高效率。尽管取得了这些进展，但在标准化条件下直接比较不同发光体仍然很少见，这使得客观评估它们的相对性能变得困难。未来的研究应优先考虑系统地评估发光体的稳定性、成本和可扩展性以及灵敏度，以指导特定实际应用的选择。

3.2.3. 电极材料及其界面的优化
电极材料是CRISPR-ECL系统中的关键组成部分，作为ECL反应的物理界面和电子转移的介质（表S2）。电极材料直接影响ECL的发光效率、信号稳定性和信噪比（Nikolaou, Valenti, & Paolucci, 2021）。同时，电极界面对Cas蛋白的空间限制使得表面修饰对于减轻空间阻碍和保持切割活性至关重要。在当前的生物传感中，玻璃碳电极和金电极因其优异的导电性、成熟的制备协议和易于修饰而占主导地位（Li et al., 2026）。然而，它们有限的比表面积限制了探针的固定能力（Yin et al., 2023）。此外，它们的二维平面结构在固液界面引入了显著的空间阻碍，抑制了Cas蛋白的活性和反应动力学。为了克服这些瓶颈，研究人员探索了电极材料的创新和表面修饰。王等人（Wang et al., 2021）使用纸质材料制造了一种柔性电极。其天然的三维多孔纤维结构提供了高表面积和可控的亲水性/疏水性，使得能够高效装载三维还原氧化石墨烯和金-钯纳米颗粒等纳米材料。这种结构还利用了纸基底的吸液作用，实现了自主且均匀的反应物传输，为开发便携式、一次性的CRISPR-ECL传感器提供了可行的路径。然而，与金属电极相比，纸质电极的导电性较低，且在水溶液中纸张膨胀可能会影响信号稳定性。在基础电极材料优化的基础上，进一步的表面修饰可以增强其物理化学性质和生物相容性。张等人（Zhang et al., 2021）使用二维材料Mxene（Ti3C2Tx）修饰电极表面，利用其高导电性和丰富的表面官能团来增加发光体和生物探针的固定能力。王等人（Wang et al., 2024）开发了一种多孔水凝胶复合材料（Au@PEI-ABEI@Pt），构建了一个三维网络结构，模拟了更接近实际生物反应的固液微环境。这种材料提供了大量的固定位点，而其相互连接的多孔通道促进了反应物的传输并有助于保持酶的活性（图5A）。下载：下载高分辨率图像（440KB）下载：下载全尺寸图像。图5. 电极材料及其界面的优化以及磁性纳米材料的集成。(A) 用水凝胶电极材料（Au@PEI-ABEI@Pt）修饰的工作电极示意图（Wang et al., 2024）；(B) 基于HRP/Au NPs纳米复合探针和CRISPR/Cas12a诱导的生物传感器的miRNA检测示意图（Wang, Zhao, et al., 2025）；(C) 基于CRISPR/Cas13a调控的miR-543 ECL-RET生物传感器的示意图（Li et al., 2025）；(D) 基于MB/mSi/Ru/A的CRISPR-ECL生物传感器的示意图（He et al., 2025）。每种不同的材料都有其优缺点。纳米结构化的金通过高表面积和等离子体增强作用最大化了灵敏度，但增加了成本和制备复杂性。纸质电极注重简单性和一次性使用，使其适用于即时检测应用，尽管在没有额外放大的情况下灵敏度可能会受到影响。水凝胶界面通过创造类似溶液的环境优化了酶的动力学，但需要仔细控制膨胀和长期稳定性。对于即时检测应用，纸质电极提供了一个实用的解决方案，特别是当与放大策略结合使用时。对于超灵敏的实验室检测，由于其高表面积和信号增强能力，纳米结构化的金电极被广泛采用。

3.2.4. 磁性纳米材料的集成优化
在CRISPR-ECL生物传感器中，磁性纳米材料由于其高比表面积和出色的磁分离能力而显示出显著的优势。高比表面积有助于高效富集信号单元，放大检测信号，而磁分离有助于从样品基质中去除干扰成分，显著抑制背景信号（Gao et al., 2025）。王等人（Wang et al., 2025）设计了一种基于磁性珠固定ssDNA-Au NPs/HRP复合探针的检测策略。目标miRNA-21激活CRISPR/Cas12a的切割活性，切割探针并释放HRP。经过磁分离后，收集含有HRP的上清液，并使用双极电极电化学发光系统进行检测，实现了0.48 fM的检测限（图5B）。李等人（Li, Yang, et al., 2025）通过构建基于电化学发光共振能量转移的生物传感器，将信号生成扩展到光学水平。磁性微球作为载体，固定了DNA功能化的金纳米棒复合物作为淬灭材料。目标激活Cas13a后，切割导致金纳米棒从磁性珠表面分离。分离后收集磁性载体并与发光体反应，实现了6.91 fM的检测限（图5C）。在此基础上，何等人（He et al., 2025）开发了一种核壳结构的磁性纳米复合材料（MB/mSi/Ru/A），将ECL发光体Ru(bpy)?2?封装在中孔二氧化硅壳中，并用Cas12a可切割的ssDNA修饰其表面。这种设计将发光体和淬灭机制集成在单个纳米载体上：在没有目标的情况下，ECL信号被淬灭；当Cas12a被激活时，电子转移恢复，导致ECL显著增强（图5D）。磁性纳米材料的设计不断进步。第一代方法仅使用磁性珠作为ssDNA探针的载体，释放后在单独的电极上进行ECL检测。这些设计是模块化和灵活的，但需要多个转移步骤。第二代设计将发光体集成到磁性载体上，实现了磁捕获后的直接检测。这简化了工作流程，但可能在洗涤过程中导致发光体渗漏。第三代策略在同一磁性载体上同时封装了发光体和淬灭剂，创建了无需外加发光体的集成“信号开启”纳米探针。这些实现了最大程度的集成，但需要复杂的合成和精确控制淬灭效率。选择哪种材料取决于具体应用。对于高通量筛选，第三代集成探针提供了简单性和速度。对于需要最小背景的复杂临床样本，由于更有效的基质去除，可能仍首选第一代分离方法。未来的研究方向可能集中在开发具有更高稳定性、更简单合成和多重编码能力的磁性纳米材料，以实现多个目标的同时检测。

3.3. 级联信号放大策略
为了实现对超低丰度目标的高灵敏度检测，将CRISPR-ECL系统与核酸放大技术集成已成为关键策略。这种方法首先利用放大作用指数级富集目标核酸，生成能够激活CRISPR-Cas系统的产物，然后将其与Cas蛋白的切割活性结合，放大ECL信号输出，从而实现双重放大效果。常用的集成技术包括聚合酶链反应（PCR）和等温放大方法，如催化发夹组装（CHA）、滚环放大（RCA）、链置换放大（SDA）、熵驱动的催化放大（EDA）和重组酶聚合酶放大（RPA）。

3.3.1. 与聚合酶链反应（PCR）的结合
PCR是一种经典的分子生物学技术，利用DNA聚合酶和热循环实现特定核酸片段的指数级放大。通过将PCR与CRISPR/Cas12a驱动的ECL生物传感器结合，张等人（Zhang et al., 2024）建立了一种高灵敏度的河豚鉴定方法。PCR高效放大目标基因片段，随后通过CRISPR/Cas12a进行特异性识别，激活切割并在电极表面切割淬灭探针，触发ECL信号。该策略能够准确区分四种河豚物种，并能在复杂肉样中检测到低至0.1%的掺假水平（图6A）。然而，PCR需要热循环设备，这可能限制了其在需要简单、低成本仪器的即时检测应用中的实用性。

3.3.2. 与催化发夹组装（CHA）的结合
CHA是一种无酶的等温放大技术，基于核酸链置换反应。其核心原理使用特定的“启动链”作为催化剂，驱动两个发夹探针的级联杂交，循环生成双链DNA产物并实现信号放大（Wang, Wang, Willner, & Wang, 2020; L. Zhao, Song, & Xu, 2024）。通过将CHA与CRISPR-Cas12a结合，吴等人（Wu et al., 2024）构建了一种用于检测胰腺癌相关tsRNA的ECL生物传感器。目标tsRNA触发CHA循环放大，生成dsDNA激活剂，激活Cas12a切割，切割标记有淬灭剂的ssDNA探针并恢复ECL信号。该方法在血清样本中实现了3.33 fM的检测限，并具有良好的选择性和重复性（图6B）。CHA的优点是无酶，降低了成本并简化了操作，但其放大效率通常低于基于酶的方法，这可能限制了某些应用的灵敏度。

3.3.3. 与滚环放大（RCA）的结合
RCA是一种等温放大技术，使用噬菌体DNA聚合酶和环状DNA模板。从与模板互补的短引物开始，聚合酶进行连续延伸，生成由重复序列单元组成的极长单链DNA产物（Cao et al., 2025）。这种线性放大的产物为后续信号放大提供了理想的多价模板。景等人（Jing et al., 2024）开发了一种基于适配体识别的ECL传感策略，触发RCA，随后激活CRISPR/Cas12a。全氟辛酸与其适配体结合后释放的单链DNA作为引物，启动RCA，产生含有多个重复序列的长链DNA。这种产物激活CRISPR/Cas12a切割，切割标记有淬灭剂的发夹探针并恢复ECL信号，在水样中实现了1.97 fM的检测限（图6C）。RCA产生的长重复产物能够实现多个信号输出，但反应相对较慢，通常需要2-4小时。

3.3.4. 与链置换放大（SDA）的结合
SDA是一种等温放大技术，依赖于限制性内切酶在特定位点切割目标DNA，以及具有链置换活性的DNA聚合酶从切口处开始合成。在延伸新链的同时，聚合酶将下游链置换，可以作为新放大循环的模板，从而实现指数级积累（Gong et al., 2021）。苏等人（Su et al., 2025）构建了一种用于检测m6A RNA的ECL生物传感器。目标m6A RNA触发T形DNA介导的链置换放大，循环产生ssDNA激活剂链。这些激活剂能够刺激CRISPR-Cas12a的转切割作用，切割经过淬灭剂修饰的探针并恢复Ru(bpy)?2?的ECL信号，在细胞RNA样品中的检测限可达到0.05 pM（图6D）。SDA在等温条件下提供指数级放大效果，但需要一种切割酶和精心设计的引物以避免非特异性放大。3.3.5. 与熵驱动的催化放大（EDA）结合：EDA是一种无酶的等温DNA放大技术，通过DNA链杂交和位移产生的熵增加来驱动放大。该策略使用单一的起始链和多个发夹探针。当起始链特异性结合到目标上时，会触发有序的链位移反应，循环打开发夹探针并生成双链DNA中间体和新的起始链，从而实现目标物质的回收和信号放大（He等人，2020；L. Zhang等人，2023）。Zhang等人（Zhang, Fan, Ding, Zhu等人，2022）通过将EDA与CRISPR-Cas12a结合，开发出一种高灵敏度的ECL生物传感器。熵驱动反应释放的DNA链与Cas12a激活剂形成三链结构，特异性抑制其转切割活性并调节ECL信号。这种传感器能够在临床和环境样品中无酶地超灵敏地检测SARS-CoV-2 RdRp基因，检测限达到32.80 aM（图6E）。EDA的优势在于无酶且背景低，但其探针设计较为复杂，需要仔细优化。3.3.6. 与重组酶聚合酶放大（RPA）结合：RPA是一种等温放大技术，利用重组酶-引物复合物扫描双链DNA，并在特定目标位点促进引物侵入和链位移，随后由链位移DNA聚合酶进行DNA合成（Behrmann等人，2020）。Li等人（Li, Liu等人，2024）通过将RPA与CRISPR-Cas12a-ECL生物传感器结合，实现了对表观遗传标记物5hmC的高灵敏度检测。RPA等温放大标记的5hmC，生成双链DNA激活剂，触发CRISPR/Cas12a的转切割作用，释放淬灭剂Au纳米颗粒并恢复ECL信号。该方法在临床和环境样品中的检测限达到0.89 fM，并成功应用于细胞和组织的5hmC定量。RPA是速度最快的等温方法之一，通常在恒定低温下20-40分钟内完成放大，非常适合快速现场应用。然而，RPA容易产生引物二聚体伪影，可能导致非特异性放大。放大策略的选择取决于具体的应用场景。PCR具有高放大效率和成熟的协议，但需要热循环。等温方法消除了对热循环仪的需求，使其更适合即时检测应用。其中，RPA速度最快，但需要多种酶；CHA和EDA无酶，但放大效率较低；RCA产生长线性产物，但相对较慢；SDA提供指数级放大，但需要切割酶。最佳选择取决于对灵敏度、速度、简单性和成本的具体要求。不同层次的优化策略各有侧重。探针设计影响Cas酶对底物的访问和切割方式。荧光团的选择决定了信号强度和稳定性。电极材料影响探针固定和电子转移效率。磁性纳米材料可实现基质分离，但增加了复杂性。放大策略提高了灵敏度，但延长了检测时间和复杂性。为了达到最佳性能，所有层次都需要协调设计。例如，高效的荧光团无法弥补因电极几何形状不当导致的探针可及性差的问题。同样，最复杂的放大策略也无法克服因界面设计不良引起的非特异性吸附造成的高背景。成功的CRISPR-ECL传感器通常在这些维度上达到平衡，而不仅仅是最大化任何一个参数。未来的发展应基于目标应用的具体需求，而不仅仅是依赖检测限的持续降低作为成功的唯一标准。从系统层面考虑探针、界面、荧光团、放大和磁性组件，对于推动CRISPR-ECL技术向实际应用迈进至关重要。4. CRISPR-ECL生物传感器的应用：CRISPR-ECL技术结合了CRISPR系统的高特异性和ECL的高灵敏度，实现了aM–fM级别的检测限，并在处理复杂实际样品时表现出有效性（表3）。这项技术为高需求场景提供了高性能、易于定制的解决方案，如精准诊断、现场快速筛查和高风险污染物监测（表S3）。它已广泛应用于多个领域，包括生物医学诊断、环境监测和食品安全（Wang等人，2022）。4.1. 疾病生物标志物检测：在疾病生物标志物检测领域，CRISPR-ECL技术提供了一种超灵敏、非侵入性或最小侵入性的诊断方法。为了提高急性肾损伤（AKI）的早期诊断能力，Xu等人（Xu等人，2023）开发了一种基于尿液样本中miRNA-21的检测策略。通过结合CRISPR-Cas13a的转切割活性和杂交链反应，该方法实现了尿液中miRNA-21的超灵敏ECL定量，为肾脏疾病的非侵入性早期诊断提供了可直接转移的实验方案（图7A）。Li等人（Li等人，2025）构建了一种基于T7 RNA聚合酶和CRISPR/Cas13a信号放大的ECL生物传感器，用于超灵敏检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）。该传感器在特异性识别MMP-2后触发级联放大反应，利用AuNPs/Ti?C?T?/Ru(II)-PEI纳米复合材料增强信号，实现了低至62.05 fM的MMP-2检测限。它表现出高灵敏度、优异的选择性和良好的稳定性，显示出在COPD等疾病早期诊断中的潜力（图7B）。尽管这些CRISPR-ECL传感器具有显著的灵敏度，检测限通常达到aM至fM范围，但将其转化为常规临床实践仍面临多个障碍。典型的检测时间（包括样品准备、核酸放大和ECL信号读取）可能长达数小时，这可能无法满足即时检测的快速周转要求（Zhou等人，2026）。在复杂生物基质（如血清或尿液）中，由于非特异性吸附和酶抑制，重现性（通常以相对标准偏差RSD表示，范围为3–8%）可能会下降（Wang等人，2026）。此外，缺乏大规模患者的严格临床验证；大多数研究仅限于加标样品或少量临床样本。从工业化的角度来看，实现关键试剂的批次间一致性和建立质量控制标准是获得监管批准（例如FDA、CE标志）的先决条件。未来的工作应优先开发标准化的样品预处理方案，并整合内部对照以校正基质效应，从而提高诊断应用的稳健性和可靠性。4.2. 病原体核酸检测：在病原体核酸检测领域，CRISPR-ECL技术展示了高通量和高度特异性的分析前景（Yu等人，2023）。Chen等人（Chen等人，2023）开发了一种基于CRISPR/Cas12a调控纳米颗粒表面电荷的ECL传感器。在该系统中，目标HPV 16 DNA激活Cas12a的转切割活性后，它会切割固定在Ru@SiO?纳米颗粒上的发夹探针，减少颗粒的负表面电荷并减弱颗粒与电极之间的静电排斥，从而显著增强ECL信号。这使得HPV 16 DNA的检测限达到3.4 fM（图7C）。Luo等人（Luo等人，2023）构建了一种基于CRISPR-Cas12a和杂交链反应协同调控纳米颗粒表面DNA长度的低背景ECL生物传感系统。在该系统中，无需复杂的电极修饰，实现了HBV-DNA的高灵敏度检测，检测限达到7.41 fM，显示出优异的分析性能和实际应用潜力。此外，Xu等人（Xu等人，2025）构建了一种基于CRISPR/Cas12a系统和自增强近红外硒基聚合物点的ECL生物传感器，用于检测单纯疱疹病毒（HSV），实现了低至0.1 fM的特异性检测，为快速临床病毒分型和环境监测提供了有力工具。CRISPR-ECL技术在病原体核酸检测方面的灵敏度可与qPCR相当甚至更高，同时避免了昂贵的光学检测设备的需求，显示出快速即时检测的巨大潜力。然而，当前系统大多依赖于纯化的核酸模板，它们对实际样品中存在的复杂基质（如咽拭子、粪便、脑脊液）的耐受性（例如PCR抑制剂和高背景核酸）需要系统评估（Lu等人，2026）。此外，由于气溶胶污染导致的假阳性风险是CRISPR基诊断从实验室向临床应用过渡必须解决的关键问题（Chen, Hu, & Zhou, 2025）。未来的研究重点应包括：开发集成的“样品进样-结果输出”全封闭自动化系统；探索无放大或超快速放大的CRISPR检测策略以简化工作流程并缩短检测时间；以及根据不同病原体的负荷和流行病学特征优化灵敏度和特异性之间的平衡，为临床解释建立明确的阈值。从全球健康的角度来看，在资源匮乏的环境中部署CRISPR-ECL技术需要解决公平性和可及性的关键障碍。现有系统通常涉及多个液体处理步骤和复杂的电极修饰，这些在缺乏训练有素的人员和设备齐全的实验室环境中难以实现（Zakiyyah等人，2025）。尽管没有系统报告每次检测的成本，但成本可能主要由昂贵的试剂和专用电极决定（Liu，2025）。为了在发展中国家广泛部署，迫切需要简化且无需仪器的平台。4.3. 环境和食品安全检测：在环境和食品安全监测领域，CRISPR-ECL技术提供了简单、低成本和高性能的检测解决方案，用于分析微量有害物质。在食品抗生素残留方面，Zhang等人（Zhang等人，2024）利用氯霉素诱导催化发夹组装（CHA）反应，激活Cas12a蛋白并切割X形DNA水凝胶结构，从而实现了无需复杂电极修饰的氯霉素敏感检测，定量限达到7.75 pg/mL。在检测水污染物方面，Ma等人（Ma等人，2023）开发了一种基于新型CD-COF发光材料的ECL生物传感系统，结合CRISPR/Cas12a技术，实现了双酚A的超灵敏检测，检测限达到2.21 fM，并已成功应用于实际环境水样的筛查（图7D）。在检测食品加工过程中产生的致癌物方面，Zheng等人（Zheng等人，2025）构建了一种基于VMSF修饰电极和CRISPR-Cas12a驱动的HRCA的ECL传感器，通过三重信号放大策略实现了N-亚硝基二甲胺的高灵敏检测，检测限达到5.33 pg/mL，显示出优异的选择性和分析性能。CRISPR-ECL在环境和食品基质中的应用显示出了有希望的结果，实现了如全氟辛酸（1.97 fM）和Hg2?（0.45 fM）等污染物的fM级别检测限（Hang等人，2022；Jing等人，2024）。然而，这些复杂样品带来了严峻挑战。来自食品提取物或天然水的基质效应可能会严重抑制ECL信号或导致假阳性/假阴性结果。大多数研究依赖于广泛的样品稀释或提取步骤，这会降低灵敏度并延长检测时间（Zhang等人，2026）。为了实现实际应用，具体的实验策略应关注：（i）开发抗污染电极涂层；（ii）实施与微流控芯片集成的在线样品预处理模块以自动化清洁步骤；（iii）设计使用空间分辨电极或光谱不同ECL发射体的多重检测格式，以同时检测多种污染物。从工业化的角度来看，常规监测的每次检测成本基准非常严格。使用贵金属纳米颗粒和定制合成的纳米材料可能在经济上不可行。探索低成本、可大规模生产的替代品，如基于碳的纳米材料，并采用具有再生协议的可重复使用传感器芯片，可以显著降低成本。最终，要从学术研究过渡到常规监测，需要使用经过认证的参考材料进行实验室间验证研究，以证明其准确性、精确性和稳健性。

4.4 其他生物分子和酶活性的检测
作为多功能分析平台，CRISPR-ECL技术已逐步扩展到各种生物分子和酶活性的检测，为基础生命科学研究提供了强大的工具支持。Zhao等人（Zhao等人，2022年）构建了一种“信号开启”型ECL传感器，其设计基于腺苷三磷酸（ATP）与其适配体结合引起的构象变化，从而调节Cas12a的切割活性。该方法实现了1.9 nM的ATP检测限，并已成功应用于血清样本中ATP的定量分析，为细胞能量代谢研究提供了新的方法。Lin等人（Lin等人，2023年）开发了一种基于CRISPR-Cas12a切割活性的ECL传感器，用于检测DNA腺嘌呤甲基转移酶（Dam MTase）的活性。该系统利用Cas12a切割单链DNA-Fc，减轻了铁氰化物对Ru-MOF的淬灭效应并减少静电排斥，从而双重增强了ECL信号；Dam MTase的检测灵敏度为23.4 mU/mL（图7E）。Li等人（Li等人，2024年）构建了一种基于DNA酶和CRISPR/Cas12a级联信号放大的ECL生物传感器，使用C–CN/PCNV异质结作为发射体，实现了对去甲基化酶FTO的高灵敏度检测。该传感器通过FTO激活DNA酶的切割活性，进而触发Cas12a在电极表面切割淬灭探针，恢复ECL信号。FTO的检测限达到0.63 pM，并已成功应用于癌细胞裂解物中FTO表达的分析和抑制剂筛选（图7F）。

CRISPR-ECL生物传感器已扩展到检测包括蛋白质在内的多种非核酸靶标。虽然这些成就突显了该平台的多功能性，但间接检测机制通常会引入额外的复杂性和变异性（Yan等人，2026年）。不同操作者和实验室之间的重复性仍然是一个问题，特别是在酶活性测定中，因为反应动力学对温度和缓冲条件非常敏感。从工业化的角度来看，开发含有冻干预分装试剂的标准试剂盒和明确的质量控制标准对于商业可行性至关重要（Hall等人，2025年）。此外，从单个样本中多重检测多个生物标志物将大大提高通量和信息含量；这可以通过使用光谱不同的ECL发光体或具有可寻址电极的空间阵列来实现。

5. 结论与展望
本综述系统总结了基于CRISPR/Cas系统与电化学发光技术整合的生物传感平台的最新研究进展。CRISPR系统凭借其高特异性和高效的信号转导能力，为生物传感提供了强大的分子识别工具。电化学发光技术由于其低背景、高灵敏度、易于量化和相对简单的仪器等优点，为信号输出提供了理想的报告平台。这两种技术的有机结合产生了一系列高性能的CRISPR-ECL生物传感器。通过不断优化和创新的传感界面、信号探针、发光体和电极基底以及信号放大策略，这些传感器的检测灵敏度、特异性和稳定性得到了显著提高。它们在多个领域展示了巨大的应用潜力和实际价值，包括疾病生物标志物检测、病原体核酸分析、环境污染物监测和酶活性评估。

尽管CRISPR-ECL技术取得了显著进展，但从实验室研究到广泛临床和现场应用的转化仍面临许多挑战。从性能指标的角度来看，当前系统可以实现极高的检测灵敏度。然而，典型的检测时间相对较长，难以满足即时检测对速度和简便性的要求。在加标缓冲溶液中重复性表现良好，但在血清和尿液等复杂生物基质中由于非特异性吸附和酶抑制作用，重复性往往会显著下降。此外，大多数当前研究仍处于概念验证阶段，缺乏基于大规模临床队列的验证和与金标准方法的严格比较。它们的临床有效性和可靠性需要进一步确认。

从工业化和商业化的角度来看，CRISPR-ECL技术的广泛应用必须克服多个障碍，包括监管批准、可扩展制造和成本控制。监管机构要求对分析和临床性能进行严格验证，包括多中心研究以确定参考区间、实验室间重复性和批次间一致性。关键试剂（如Cas蛋白、修饰寡核苷酸和纳米材料发光体）的批次间稳定性是可扩展生产必须解决的核心问题。需要建立标准化的表达、纯化过程和质量控制系统。就成本而言，当前的研究级原型相对昂贵，限制了其商业潜力。开发低成本、可扩展的替代材料（如一次性丝印电极、高产重组酶和地球上丰富的纳米材料）至关重要。

从全球健康的角度来看，在资源有限的环境中部署CRISPR-ECL技术需要特别关注公平性和可及性。当前系统通常依赖于复杂的多步骤液体处理和精确的电极修饰，使其不适合在缺乏训练有素的人员和设备齐全的实验室中推广。为了实现广泛应用，未来的平台设计必须优先考虑几个因素：在室温下试剂的稳定性（如冻干配方）以消除对冷链的依赖；操作简便性（如集成的“样品加入-结果输出”卡盒）；设备便携性（如基于智能手机的微型化电化学发光读数器）；以及低成本制造（如基于纸张的微流控芯片）。此外，应优先考虑发展中国家中普遍存在的疾病的检测需求，包括结核病、疟疾、HIV/AIDS和被忽视的热带疾病，以最大化这项技术的全球健康效益。

展望未来，CRISPR-ECL生物传感技术的发展需要继续在以下方向推进。首先，简化工作流程和集成：开发一步法、均相反应系统，将目标识别、CRISPR激活和电化学发光信号生成集成在单一溶液中，消除繁琐的电极清洗和转移步骤。探索无需扩增或超快扩增的CRISPR检测策略，以显著缩短检测时间，并促进完全封闭的自动化“样品加入-结果输出”设备的发展。其次，提高在复杂基质中的稳健性：设计用聚乙二醇、两性离子材料或水凝胶改性的抗污染电极界面，有效抵抗来自复杂样本的蛋白质、脂质和腐殖酸的非特异性吸附。集成在线样品预处理模块（如过滤、提取或磁分离），实现自动化清洗并减少手动操作错误。第三，建立标准化的验证系统：开发CRISPR-ECL检测的参考材料和质量控制标准，包括认证的DNA/RNA靶标、阳性/阴性对照和校准曲线。进行多中心环试以评估实验室间重复性。发布详细的标准操作程序，为技术转移和监管批准奠定基础。第四，实现多重检测：利用光谱分辨的电化学发光发射体或空间可寻址电极阵列，实现单个样本中多个目标的同时检测，提高检测通量。第五，整合智能技术：引入人工智能和机器学习进行自动化数据解释、异常检测和质量控制，构建能够适应不同样本条件的智能诊断系统。结合物联网技术实现远程数据传输和实时监测，支持公共卫生监测。

总之，CRISPR-ECL技术作为下一代分子诊断平台具有巨大潜力。通过系统地解决工作流程简化、基质耐受性、标准化、多重检测和成本控制等挑战，并将全球健康公平性纳入设计理念，这项技术有望从学术探索过渡到实际应用。它可以为精准医疗、传染病监测、食品安全和环境监测提供强大的工具，最终促进先进诊断技术在世界各地的广泛应用，改善人类健康和福祉。

作者贡献声明：
Xiaoyun Yin：撰写——原始草稿、验证、研究。
Ze Fan：撰写——审阅与编辑、研究。
Zhaoyang Tonga：撰写——审阅与编辑、监督、概念化。

未引用的参考文献：
Li等人，2024年
Li等人，2024年
Li等人，2025年
Liu等人，2022年
Mei-Ling, Yi, Mei-Ling, Ying和Xiao-Jing，2022年