《International Journal of Biological Macromolecules》：Microwave-engineered gum ghatti-
graft-poly(acrylic acid)/TiO
2 bionanocomposites as reusable high-performance adsorbents for wastewater dye removal
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耐盐耐热β-葡萄糖苷酶在生物精炼中的应用研究。该研究鉴定了两种来自嗜热菌Thermothelomyces thermophilus的重组酶TthBgl3A和TthBgl3C的特性，发现TthBgl3C在0.5M NaCl和50℃条件下保持80%活性，并显著提升 cellobiose 水解效率67%。其离子耐受性和高温稳定性使其在未清洗甘蔗原料的预处理后直接进行水解具有潜力，总糖产量提升78%，为海水基生物精炼提供新酶源。
安娜·卢伊扎·达·罗查·福尔特斯·萨拉伊瓦（Ana Luiza da Rocha Fortes Saraiva）|马塞乌斯·I.B.阿拉贡（Matheus I.B. Arag?o）|加布里埃拉·莱拉·贝托（Gabriela Leila Berto）|玛莎·伊内斯·维莱兹·梅尔卡多（Martha Inés Vélez Mercado）|莱安德罗·克里斯坦特·德·奥利维拉（Leandro Cristante de Oliveira）|费尔南多·塞加托（Fernando Segato）
巴西圣保罗大学洛雷纳工程学院（Lorena School of Engineering）生物技术系
摘要
生物精炼厂是实现长期循环经济的关键驱动力。耐盐酶在存在抑制性离子和盐的情况下仍能保持活性，这使得可以利用非饮用水资源高效转化生物质。这一策略通过减少对饮用水的依赖，支持更加环保和经济可持续的工艺。在本研究中，我们报道了来自Thermothelomyces thermophilus的两种重组β-葡萄糖苷酶（TthBgl3A和TthBgl3C）的生化特性，特别关注了它们的热稳定性和对Na+、K+、Ca2+等离子的耐受性——在50°C、0.5 M NaCl条件下，这两种酶的相对活性在48小时内仍可保持80%。在纤维素水解过程中，TthBgl3C使葡萄糖的释放量增加了67%。此外，在0.5 M NaCl条件下，将TthBgl3C添加到商业酶混合物（NCL）中用于纤维素水解后，总糖产量提高了78%。当应用于预处理的甘蔗时，NCL + TthBgl3C混合物使葡萄糖转化率提高了高达123%。这些结果表明TthBgl3C是补充酶混合物以优化盐碱条件下生物质转化的有希望的候选酶。
引言
在生物精炼厂中利用木质纤维素生物质需要对其进行生物转化，这一过程包括三个主要步骤：预处理、糖化以及发酵，这些步骤可以单独进行，也可以同时进行。预处理对于克服木质纤维素的固有抗性、实现高效生物质利用至关重要[1]。然而，某些预处理方法（尤其是化学方法）会产生抑制性化合物，并提高反应介质中的盐浓度，从而复杂化后续的糖化过程。为了减轻这些影响，预处理后的生物质通常需要经过大量洗涤以降低盐分和抑制剂的含量[2]、[3]。
目前的估计显示，生产1升乙醇需要1.9到9.8升饮用水，这显著影响了该过程的可持续性和经济效益[4]。为了解决这一问题，人们提出了替代策略，包括使用海水代替淡水进行木质纤维素的生物转化[5]、[6]。然而，海水的高盐度限制了其实际应用。耐盐微生物和酶为生物过程适应盐碱条件提供了有希望的解决方案。如果这些酶还具有热稳定性，它们还可以被纳入同时进行的糖化和发酵过程中，从而缩短处理时间和降低运营成本[7]。
在木质纤维素糖化过程中，纤维素水解主要由三类酶完成，其中β-葡萄糖苷酶（BGL）通过分解纤维素和低聚纤维素来发挥核心作用。BGL的活性对于防止纤维素积累至关重要，因为纤维素积累会抑制其他纤维素酶的活性并降低整体水解效率[8]、[9]、[10]。发现和开发具有增强抗抑制性和耐盐性的热稳定BGL是一种有前景的策略，可以提高糖产量、降低生产成本并减少对淡水的需求。这类酶能够直接使用未经洗涤的预处理生物质，支持基于海水的水解，并促进同时进行糖化和发酵的过程。
在循环经济的框架下，开发含有耐盐水解酶的酶混合物是建立基于海水的生物精炼厂的有希望的方法。在本研究中，我们报道了来自Thermothelomyces thermophilus的耐盐重组β-葡萄糖苷酶（TthBgl3C）的生化和功能特性，并将其与之前描述的TthBgl3A进行了比较[11]。该酶在热稳定性、对高浓度NaCl及不同离子的耐受性以及针对纤维素和木质纤维素底物的水解性能方面进行了评估。这些特性对于开发能够缓解预处理产生的盐分和抑制性化合物带来的瓶颈、同时减少生物质洗涤步骤的需求至关重要。
微生物菌株和化学品
T. thermophilus M77和Aspergillus nidulans A773菌株来源于圣保罗大学（EEL-USP）生物技术系合成与分子生物学实验室的微生物收藏。使用麦芽糖（WE Consultoria，巴西）作为异源蛋白表达的诱导剂。寡核苷酸（Exxtend Biotechnology Ltd., 巴西）和Phusion高保真DNA聚合酶（New England Biolabs, 美国）通过聚合酶链反应（PCR）进行基因扩增。
TthBgl3C的表达、纯化和脱糖
编码TthBgl3C的基因成功克隆并在A. nidulans中实现了异源表达。通过使用 auxotroph 回归标记筛选出转化体，这种转化体能够在缺乏尿嘧啶和尿苷的情况下生长。通过 SDS-PAGE 分析确认蛋白质分泌到麦芽糖诱导的培养基中（图1A）。在大约94.8 kDa处检测到与TthBgl3C相对应的条带，这与其在ProtParam服务器上的预测分子量一致。随后对该酶进行了进一步研究。
结论
在本研究中，两种TthBgl3变体均表现出增强的热稳定性和在盐碱条件下的优异性能。总体而言，结果表明TthBgl3C在50°C下的热稳定性更优，对Ca2+、K+、Co2+和Li+等离子的耐受性也更强。特别是在纤维素水解过程中，当NaCl浓度高达0.5 M时，TthBgl3C表现出出色的稳定性和催化活性，从而显著提高了糖的产量。
CRediT作者贡献声明
安娜·卢伊扎·达·罗查·福尔特斯·萨拉伊瓦（Ana Luiza da Rocha Fortes Saraiva）：撰写——审稿与编辑、原始草稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析。马塞乌斯·I.B.阿拉贡（Matheus I.B. Arag?o）：原始草稿撰写、验证、方法学设计、数据分析、数据管理。加布里埃拉·莱拉·贝托（Gabriela Leila Berto）：原始草稿撰写、数据可视化、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。玛莎·伊内斯·维莱兹·梅尔卡多（Martha Inés Vélez Mercado）：原始草稿撰写、数据可视化、方法学设计、数据分析。莱安德罗·克里斯坦特·德·奥利维拉（Leandro Cristante de Oliveira）：
写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
我们声明本章中使用的图像均由作者独立创作。部分符号的选用也是作者自主决定的。
利益冲突声明
作者声明他们没有可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢圣保罗州研究基金会（FAPESP，资助编号：2020/07015-7、2021/06679-1、2022/04227-9、2022/04713-0）和国家科学技术发展委员会（CNPq，资助编号：442352/2014-0、309861/2023-3、303276/2021-5、301342/2025-3）提供的财务支持。本研究还得到了巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES，资助代码001）的部分资助。本研究使用了相关资源。
