NordiQC中IHC p53检测的性能：需要重新校准IHC检测方法

《Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology》：IHC p53 Performance in NordiQC: Recalibration of IHC Assays is Needed

　　**摘要（通俗语言总结）**
TP53基因是人类癌症中最常发生突变的基因，大约50%的恶性肿瘤中都存在该基因的异常。当优化得当时，p53免疫组化（IHC）可以作为检测TP53突变的可靠替代方法。然而，许多实验室难以识别除过表达之外的其他p53 IHC反应模式，尤其是缺失型、细胞质型和野生型模式。随着这些额外模式的临床意义逐渐被认识到，NordiQC在2021年更新了其评估标准，将野生型和缺失型模式纳入评估范围，这增加了p53 IHC的复杂性，并揭示了各实验室之间普遍存在的困难。在这项研究中，我们分析了2007年至2024年间6次连续的NordiQC外部质量评估数据，共涵盖了1,796份提交的p53 IHC检测结果。研究发现，虽然大多数实验室能够可靠地检测到高水平的抗原过表达，但许多检测方案无法充分显示低水平的p53表达，从而限制了IHC检测的有效性。即用型产品（尤其是按照制造商建议使用时）的表现也不尽如人意。这些试剂盒仅针对过表达情况进行校准，导致其他突变相关模式的检测结果出现假阴性或过弱的情况。我们的数据代表了迄今为止对p53 IHC检测性能最全面的评估。研究结果强调了迫切需要重新校准p53 IHC检测方案，特别是提高分析灵敏度并确保内部和外部质控的一致性。通过调整IHC检测方案以识别所有类型的TP53突变（包括缺失型和野生型突变），可以显著提高p53 IHC的诊断准确性。

**常见问题解答**
TP53蛋白由TP53基因编码，在调节细胞生长和分裂中起核心作用。当检测到DNA损伤时，p53会暂停细胞周期以允许修复，或在无法修复时诱导细胞凋亡，从而防止肿瘤形成。TP53基因是癌症中最常发生突变的基因，约50%的癌症病例中存在该基因突变。使用p53免疫组化（IHC）检测这些突变具有挑战性，尤其是对于过表达以外的其他模式（如缺失型和野生型）。NordiQC在2021年更新了评估标准，将这两种模式纳入评估范围，发现各实验室普遍存在相关问题。通过对2007年至2022年的1,796份p53 IHC检测结果进行分析，研究发现许多实验室难以检测到低水平的p53表达，影响了检测结果的准确性。即用型试剂盒往往无法检测到非过表达模式，导致结果不准确。因此，需要重新校准p53 IHC检测方案以提高诊断准确性。

**技术细节**
Nordic免疫组化质量控制（NordiQC）是一个独立的学术性外部质量评估项目，涵盖60多个国家的700多家实验室。NordiQC向参与实验室提供未染色的组织切片，由实验室使用常规方案进行染色。专家团队根据参考标准对切片进行集中评审，并发布详细的评估报告，指出性能指标、常见问题和最佳实践建议。NordiQC已对p53检测进行了6次评估，自调整评估标准后（包括检测野生型和缺失型模式）以来，p53检测的通过率显著下降。本文概述了NordiQC的评估结果，发现所有即用型（RTU）产品按照制造商建议使用时都无法满足识别其他p53反应模式的要求。

**材料与方法**
在早期的NordiQC评估中（2007年、2013年），组织微阵列（TMA）主要用于展示p53过表达并验证适当的对照组织，反映了当时p53 IHC应用的局限性。在最近的4次评估中（2021年、2022年、2023年、2024年），评估范围扩展到了p53过表达、缺失型和野生型模式，TMA的构建也相应进行了调整（见表1）。

**表1：2007年至2024年6次p53评估的TMA内容**
| 评估年份 | 过表达模式 | 缺失型模式 | 野生型模式 | 对照组织 |
|---------|---------|---------|---------|---------|
| 2007年 | 卵巢癌≥75%的肿瘤细胞、结肠腺癌≥50%的肿瘤细胞以及子宫内膜样癌5%-20%的肿瘤细胞出现强烈核染色 | 未包含 | 未包含 | 结肠和输卵管基底上皮细胞中无核染色或仅有弱核染色；肝脏无染色 |
| 2013年 | 卵巢癌和结肠腺癌几乎所有肿瘤细胞以及尿路上皮癌大多数肿瘤细胞出现中度至强烈核染色 | 未包含 | 未包含 | 扁桃体生发中心B细胞≥20%、输卵管上皮细胞及阑尾基底隐窝中出现弱至中度核染色；扁桃体次级滤泡的 mantle zone B细胞核染色<10%，结肠腔上皮细胞无染色 |
| 2021年、2022年、2023年、2024年 | 卵巢癌几乎所有肿瘤细胞出现中度至强烈核染色 | 子宫内膜浆液性癌肿瘤细胞无染色；分散的间质细胞、淋巴细胞和内皮细胞至少显示弱核染色 | 低级别子宫内膜癌大多数肿瘤细胞出现弱至中度核染色；分散的间质细胞、淋巴细胞和内皮细胞至少显示弱核染色；扁桃体生发中心B细胞≥20%/≥50%以及阑尾基底隐窝上皮细胞显示弱至中度核染色 | 阑尾腔上皮细胞无染色；mantle zone B细胞<10%/≤50%显示弱至中度核染色 |

**结果分析**
2007年至2024年间，共进行了6次NordiQC p53 IHC评估，参与实验室数量从2007年的93家增加到2024年的397家，共评估了1,796份p53 IHC检测结果。多年来，达到合格（最佳或良好）结果的实验室比例有所波动：2007年为68%，2013年为79%，2021年下降至46%，2023年和2024年回升至65%（图1）。尽管近年来通过率略有提高，但p53 IHC检测仍具有挑战性，仍有35%的实验室使用的检测方案不符合诊断要求。

**单克隆抗体DO-7和BP53-11的表现**
多年来，单克隆抗体DO-7和BP53-11始终表现出最佳检测效果。这些抗体在所有主要IHC系统（Dako/Agilent、Ventana/Roche、Leica Biosystems）中均获得了最佳结果。有效的热诱导表位回收（HIER）技术、准确校准一抗滴度以及使用三层检测系统对于实现最佳性能至关重要。自2021年以来，即用型抗体成为参与实验室的首选。2024年的评估中，77%的实验室选择了即用型抗体，而2007年这一比例为6%。然而，对比即用型抗体和浓缩抗体发现，浓缩抗体通常具有更高的通过率。2024年，基于浓缩抗体的检测方案通过率为71%，而即用型抗体通过率为63%。不同抗体格式之间的通过率差异具有统计学意义（χ2检验 = 24.5，df = 2，P < 0.001），主要原因是即用型抗体在按照供应商推荐方案使用时表现不佳。

**结论**
NordiQC的评估表明，即用型产品虽然能快速且经济地检测TP53突变，但必须经过验证以确保其反应模式能准确反映不同的突变类型。自2021年以来，NordiQC的评估结果一致表明，导致检测结果不充分的常见原因是染色反应过弱或假阴性。所有实验室在p53过表达的样本中都观察到了高水平的抗原表达。然而，在低水平抗原表达的细胞（如基质细胞、淋巴细胞和内皮细胞）以及扁桃体中的生发中心和小 mantle 区 B 淋巴细胞中检测 p53 时遇到了更大的挑战。准确识别无 TP53 突变的肿瘤细胞中的野生型 p53 表型以及 TP53 突变肿瘤细胞中的无表达型需要一个经过仔细校准的检测方案（图2）。例如，在2024年，仅有15%的不充分结果是由于假阴性或染色反应过弱以外的原因造成的，如信噪比低或背景染色过强等技术问题，而真正的假阳性反应占所有不充分结果的5%。

**图2：使用相同一抗的两种不同方案对5个样本进行p53染色**：一种是实验室修改和优化的方案（A、C、E、G、I），另一种是供应商推荐的方案（B、D、F、H、J）。两种方案均使用 mAb 克隆 DO-7 作为 Ready-To-Use (RTU) 试剂，适用于 Benchmark Ultra (Ventana/Roche) 系统，并采用 OptiView 作为检测系统。优化方案（修改后的设置）：在 CC1 中进行 HIER 染色 64 分钟，一抗孵育 32 分钟；供应商推荐的方案：在 CC1 中进行 HIER 染色 32 分钟，一抗孵育 16 分钟。（A–D）对照组织中的 p53 染色反应。（A、B）扁桃体中的 p53 染色反应。优化方案（A）在大多数生发中心 B 细胞中显示出弱到中等的核染色反应，而 <50% 的小 mantle 区 B 细胞显示出 p53 反应；供应商推荐的方案（B）的灵敏度显著降低，只有 <50% 的生发中心 B 细胞显示出核 p53 反应。（E、F）p53 过表达的子宫内膜浆液性癌中的 p53 染色反应。优化方案（E）在所有肿瘤细胞中产生强烈且均匀的核染色反应；供应商推荐的方案（F）虽然也显示出 p53 过表达，但染色强度较弱。（G、H）野生型 p53 表型（无 TP53 突变）的低级别子宫内膜癌中的 p53 染色反应。优化方案（G）在所有肿瘤细胞中产生弱到中等的核染色反应；供应商推荐的方案（H）的染色反应显著减弱，可能导致将病例误判为无 p53 表型，尤其是在存在 TP53 突变的病例中。（I、J）无 p53 表型的子宫内膜浆液性癌中的 p53 染色反应。优化方案（I）正确地显示肿瘤细胞中无核染色，而基质细胞显示出弱到中等的染色，作为内部阳性对照；供应商推荐的方案（J）缺乏基质细胞的染色反应，使得无法确定 p53 的状态。

导致检测结果不充分的主要因素包括使用灵敏度较低的检测系统、HIER 技术效果不佳以及一抗浓度不足。这些问题已通过针对各实验室的反馈得到了解决。

**讨论**：多年来，我们对 TP53 分子变化与 p53 IHC 染色反应模式之间关联的理解不断加深，这为 p53 IHC 提出了新的挑战。最新的 NordiQC 评估结果显示，尽管所有参与实验室都能检测到 p53 过表达，但往往无法识别其他染色反应模式。随着临床对 p53 检测要求的改变，NordiQC 的评估标准在2021年进行了更新，增加了对野生型和无表达型的检测，导致通过率大幅下降。其中一个主要问题是 RTU 抗体的性能不佳。这似乎与市场上几乎所有 RTU 产品仅针对过表达模式进行校准有关，因为这些产品是在其他染色模式被发现之前开发的。虽然这些产品能够有效检测过表达，但它们并不符合当前的诊断需求，因此迫切需要重新校准。这一问题因所有相关 RTU 抗体均依据体外诊断法规（IVDR）使用 VRPS 进行验证而更加突出。这意味着如果严格遵循 IVDR 规定，p53 IHC 的性能将会明显下降。临床上，这可能导致 TP53 突变肿瘤的漏诊或误分类，尤其是那些表现为无染色或胞质染色模式的肿瘤。因此，患者可能会错过适当的治疗机会，直接影响治疗效果。据我们所知，这是迄今为止规模最大的跨多个实验室比较 p53 IHC 质量的研究。此前没有研究在如此广泛的技术条件下对 p53 IHC 检测进行过质量评估。通过涵盖多种方法和实验室环境，我们的研究全面评估了检测性能，并强调了影响 p53 IHC 检测质量和诊断可靠性的关键因素。虽然外部质量保证只能提供个别实验室性能的快照（存在预期波动），但同时评估多个实验室有助于发现系统性问题。当多个实验室遇到相同问题时，说明这是全球范围内的普遍现象，而不仅仅是个别实验室的错误。并非所有实验室会同时更换抗体或犯同样的技术错误。本研究分析的大量协议和结果数据证实了2021年首次发现的系统性问题。幸运的是，那些修改了检测方案的实验室已经看到了改进，但大多数市售 RTU IHC 系统仍需重新校准和验证，以彻底解决 p53 IHC 相关的持续挑战。为了支持实验室进行这一过程，NordiQC 在其网站上发布了在评估中表现最佳的检测方案。这些方案可在 www.nordiqc.org 的“推荐方案”页面找到，旨在为实验室提供本地验证和优化 p53 IHC 检测的可靠起点。此外，所有未通过 p53 评估的实验室都会收到 NordiQC 的具体个性化建议，指导如何优化其检测方案。这些建议基于 NordiQC 的数据分析，并针对每个实验室提交的检测方案进行定制。然而，本研究的结果必须在其局限性范围内解读。我们的组织切片（TMA）样本选择有限，包含的肿瘤和正常组织类型也较为有限。如果能有更多代表多种癌症类型的样本，研究结果将更具代表性。将我们的结果与其他外部质量评估项目的结果进行比较，我们发现类似的情况。美国病理学家协会2021至2022年的调查显示，在117个参与实验室中，仅有5个 TMA 样本获得了≥80%实验室的一致认可。导致错误结果的主要原因是染色反应过弱，从而将过表达模式误判为野生型模式或无表达型。2023年11月加拿大病理质量保证项目（Run 206）对子宫内膜癌的 p53 检测结果显示，约三分之一的实验室无法准确检测出无表达型，因为染色反应太弱，无法在背景中显示野生型对照的存在。尽管如此，所有实验室仍根据其内部评估标准通过了能力测试。验证成功的 p53 IHC 检测的关键在于其内在的组织质量控制，这有助于评估检测的灵敏度。这一结论基于一个公认的事实：基质细胞、内皮细胞和淋巴细胞（这些细胞普遍存在于大多数组织样本中）始终显示出野生型 p53 反应。非肿瘤组织中存在这种野生型模式为检测提供了可靠的参考，表明检测灵敏度足够，并且对于识别因 TP53 突变导致 p53 失失的肿瘤至关重要。除了强调内部对照的价值外，我们的结果还强调了选择适当外部对照的重要性，最好是切片上的对照。由于主要问题是假阴性结果和灵敏度下降，仅使用过表达模式的肿瘤组织无法提供关于检测灵敏度和重复性的有效信息。因此，建议使用低水平表达 p53 的外部组织（如扁桃体和阑尾/结肠）作为对照。总之，优化 p53 IHC 检测以适应不同的 TP53 突变类型是提高诊断准确性的关键。NordiQC 的结果揭示了全球范围内系统性的挑战，这些挑战正在影响 p53 IHC 检测的诊断性能。迫切需要重新校准和验证 IHC p53 检测，特别是针对广泛使用的商业 RTU 系统。