石墨炉原子吸收光谱法(Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry, GFAAS)测定小鼠脏器中总锑(Sb)方法的验证

《ACS Omega》：Validation of a Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry (GFAAS) Method for Determining Total Antimony in Organs of Mice

　　

七十多年来，锑(Sb)类药物一直是治疗利什曼病(leishmaniasis)的主力药物，尽管其具有显著的心脏、肝脏及肾脏毒性。因此，开发替代性Sb基制剂至关重要，而脂质体药物递送系统代表了一种降低毒性并改善治疗效果的有前景的策略。本研究通过验证石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)在不同生物基质——心脏、肝脏、脾脏、肾脏及血浆中定量Sb的分析方法，来评估Sb的定量检测能力。方法验证依据INMETRO DOQ-CGCRE-008指南进行，评估了基质效应(matrix effect)、线性(linearity)、检出限(Limit of Detection, LoD)、定量限(Limit of Quantification, LoQ)、准确度(accuracy)及精密度(precision)。所有评估组织均观察到显著基质效应，强调了使用基质匹配校准曲线(matrix-matched calibration curves)的必要性。器官和血浆分别在20–100 μg/L及20–120 μg/L范围内显示线性，相关系数(r)超过0.99。LoD值范围为0.10–3.1 mg/kg，LoQ值确认介于0.3–10.4 mg/kg之间，加标回收率为93%–97%。准确度评估回收率为90%–109%，精密度通过日内和日间分析评估，相对标准偏差(Relative Standard Deviation, RSD)低于7%，HorRAT值(Horwitz ratio)小于1.0。该方法被证明可靠、重现性好且灵敏，满足所采用指南的验证标准。鉴于Sb的药代动力学及生物分布特征已在研究人员前期工作中建立，本文验证的方法强化了正在进行及未来Sb基制剂临床前评估所需的分析基础。

论文解读：石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)测定小鼠脏器中总锑(Sb)方法的验证

本研究发表于《ACS Omega》。目前，五价锑(Sb⁵⁺)类药物虽是治疗内脏利什曼病的首选，但其治疗窗窄且具剂量依赖性脏器毒性（心、肝毒性），促使研究人员开发脂质体包裹酒石酸锑钾(Lip-TE)等新剂型以降低毒性。然而，评价新剂型的药代动力学(Pharmacokinetic, PK)、生物分布(Biodistribution)及毒性高度依赖于能在复杂生物基质中准确定量总Sb的分析方法。既往报道的Sb定量方法多局限于人/犬的少数基质（如肝、血浆），缺乏针对小鼠心脏、脾脏、肾脏等多脏器的系统验证。为此，研究人员依据INMETRO、ICH Q2(R1)及Eurachem指南，建立并验证了采用石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)配备塞曼背景校正(Zeeman background correction)测定BALB/c小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏及血浆中总Sb含量的分析方法，证实需采用基质匹配校准以消除基质效应，方法灵敏度、准确度及精密度符合法规要求，并初步应用于腹腔注射给药后15 min的小鼠Sb生物分布考察。

主要关键技术方法

研究人员选用雌性BALB/c小鼠（7–8周龄，n=7）获取空白脏器及血浆制作基质匹配校准曲线，另设实验组给予腹腔注射(ip)酒石酸锑钾(Tartar Emetic, TE)等效Sb 8 mg/kg。脏器经硝酸-过氧化氢消解块酸消解法(digestion block acid digestion)处理，血浆经Triton X-100及锆(zirconium)基体改进剂处理。采用配备 polarized Zeeman background correction的GFAAS（Agilent 240Z AA系列，pyrolytic graphite-coated tubes），以峰高(peak height)定量，按INMETRO DOQ-CGCRE-008指南评估基质效应（Student's t-test、Cochran's test）、线性（Shapiro–Wilk检验残差正态性）、LoD/LoQ（空白标准偏差法，LoQ经10次平行加标验证）、准确度（加标回收率，三浓度水平，n=6）及精密度（日内repeatability与日间intermediate precision，计算RSD及HORRAT）。

2.1. Evaluation of Matrix Effect（基质效应评估）

研究人员分别在各生物基质消化液及纯溶剂（0.5%或4% HNO₃）中配制校准曲线，经Shapiro–Wilk检验确认残差正态、Cochran检验确认方差齐性后，采用Student's t-test比较各浓度点响应。结果显示所有基质中溶剂曲线与基质曲线均值差异显著（p < 0.05），证实存在显著基质效应，故全验证过程均采用基质匹配校准曲线进行定量。

2.2. Determination of the Linearity（线性范围确定）

在基质匹配条件下，心脏、肝脏、脾脏、肾脏线性范围为20–100 μg/L，血浆为20–120 μg/L。各回归残差符合正态分布且方差齐（Cochran's test, p > 0.05），无异常值（Jackknife residuals）。所有基质线性回归相关系数(r)均 > 0.995（满足ICH Q2(R1)要求r ≥ 0.99），决定系数(R²)为0.9913–0.9995。溶剂与基质匹配曲线斜率及截距差异进一步佐证基质效应存在，支持使用基质匹配校准。

2.3. Determination of LoD and LoQ（检出限与定量限确定）

基于10份空白基质测定标准偏差计算得LoD与LoQ。脏器LoD为0.8–3.1 mg/kg，LoQ为2.6–10.4 mg/kg；血浆LoD为0.1 mg/L，LoQ为0.3 mg/L。在LoQ浓度下做10次平行加标测定，回收率为93%–97%（肝脏LoQ最高为10.4 mg/kg，其余较低），符合AOAC对 > 100 ppb浓度下80%–110%回收率的要求，确认方法具备足够灵敏度检测痕量Sb。

2.4. Determination of the Accuracy（准确度确定）

以空白基质预先加标Sb标准溶液（脏器：20、60、100 μg/L；血浆增120 μg/L），每个水平n=6。各基质平均回收率为90%–109%，RSD ≤ 7.1%，均在AOAC推荐可接受范围内（低浓度80%–110%，高浓度90%–107%），表明方法具有良好的正确度(trueness)。

2.5. Determination of the Precision（精密度确定）

同三个加标浓度水平于两天内各测六次(n=6)，评估重复性与中间精密度。各基质日内与日间RSD均 < 7%（多数 < 5%），HORRAT < 1.0，F检验显示两天间方差无显著差异(p > 0.05)，表明方法重现性良好且受日间变异影响小。

2.6. Determination of Samples Following Intraperitoneal Administration（腹腔给药后样本测定）

TE（等效Sb 8 mg/kg, ip）给药15 min后取小鼠样本测定。肝脏Sb蓄积最高（25.9 ± 7.4 mg/kg），其次为脾脏(4.6 ± 2.1 mg/kg)、肾脏(3.9 ± 1.1 mg/kg)、血浆(1.5 ± 0.8 mg/L)，心脏未检出（低于LoD或早期未分布入心）。结果符合网状内皮系统器官（肝、脾）优先摄取Sb的代谢特征，提示本验证方法可支持早期分布相的定量研究。

讨论与结论总结

研究人员指出所有组织尤其是肝脏与血浆存在明显基质效应，归因于高蛋白、内源性硫醇及脂质干扰原子化效率，必须使用基质匹配校准。方法线性、LoD/LoQ、准确度（回收率90%–109%）及精密度（RSD < 7%，HORRAT < 1.0）均满足INMETRO、AOAC及ICH Q2(R1)要求。早期生物分布数据显示肝脏为Sb主要储积器官。该方法为后续含Sb制剂（含脂质体TE）的临床前PK、生物分布及毒理研究提供了可靠分析基础。

结论（翻译）

验证结果证实，所建立的GFAAS方法适用于消解后小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏及血浆中Sb的定量测定。依据INMETRO、AOAC及ICH Q2(R1)指南，该方法在评估浓度范围内展现出良好的线性、灵敏度、准确度与精密度。经统计检验证实，采用基质匹配校准曲线对于消除基质效应至关重要。检出限与定量限足够低以检测痕量Sb，且LoQ水平回收率满足法规要求。回收率与精密度结果进一步支持该方法在复杂生物样品中的可靠性。鉴于其性能表现，本方法可可靠应用于涉及锑基化合物的药代动力学、生物分布及毒理学研究中。