基于MALDI 原位杂交(in situ hybridization, ISH) 质谱成像(mass spectrometry imaging, MSI) 整合脂质与基因表达的空间多组学分析方法

《Analytical Chemistry》：Spatial Multiomics Combining Lipids and Gene Expression Using MALDI ISH MSI

　　

当前的空间基因表达技术依赖于DNA微阵列、二代测序(next-generation sequencing, NGS)及荧光显微镜，通常存在成本高、耗时长及采样区域受限等问题。基质辅助激光解吸/电离原位杂交(matrix-assisted laser desorption/ionization in situ hybridization, MALDI ISH) 质谱成像(mass spectrometry imaging, MSI) 将原位杂交的时空分辨能力与MSI相结合，利用光可裂解(photocleavable, PC) 肽质量标签(peptide mass tag) 和核酸探针实现对脂质组与基因表达数据的连续检测。研究人员合成了一种兼容固相肽合成(solid phase peptide synthesis, SPPS) 的铜催化叠氮-炔环加成反应(copper-catalyzed azide–alkyne cycloaddition, CuAAC) 邻硝基苄基叠氮连接子(o-nitrobenzylic azide linker)，构建了DNA序列与肽质量标签间灵活且模块化的偶联平台。将质量标签与靶标原生RNA杂交后，三唑功能化的邻硝基苄基连接子在紫外光照下发生光解，使杂交核酸序列与其对应的肽质量标签分离。利用该方法，研究人员合成了33种独特的光可裂解mRNA探针，并在野生型及Canavan病(Canavan's disease) 模型小鼠脑矢状冰冻切片上成功验证了12种不同基因的表达模式。该方法可在同一组织切片上共检测原生RNA和脂质组信号，为空间多组学分析提供了替代策略。虽然本研究展示了12重(12-plex) 实现方式，但该平台具有可扩展性，通过持续优化肽设计及仪器有望支持更高通量多重检测。该方法广泛适用于各类疾病模型，可为转录组–代谢组相互作用提供新的见解。

论文解读：《Spatial Multiomics Combining Lipids and Gene Expression Using MALDI ISH MSI》发表于《Analytical Chemistry》

一、研究背景与意义

传统空间基因表达检测手段如单分子荧光原位杂交(single molecule fluorescence in situ hybridization, smFISH)、MERFISH、Xenium（10x Genomics）及GeoMx Digital Spatial Profiler（Nanostring）等，虽能提供亚细胞分辨率，但受限于荧光光谱串扰导致的同时检测通道数少（通常<7）、仪器昂贵、流程耗时、成像面积或样本量受限等问题。已有的空间多组学多依赖连续切片关联分析，无法在同一物理位点上直接共定位代谢物（如脂质）与RNA。基质辅助激光解吸/电离质谱成像(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging, MALDI MSI) 具备高动态范围、高灵敏度（可达attomole级）、高空间分辨率（<10 μm）及同时检测数千种分子的能力。已有研究尝试将光可裂解(photocleavable, PC) 肽质量标签(peptide mass tag) 用于免疫组化(MALDI IHC) 或寡核苷酸标记(Tag-Mass)，但针对RNA的原位杂交结合酶促信号放大与模块化CuAAC点击化学连接的MALDI ISH MSI完整方案仍有待完善。本研究旨在建立一种成本可控、高通量、可在同一冰冻组织切片上同时获得非靶向脂质信息与靶向mRNA表达信息的空间多组学方法——MALDI ISH MSI。

二、主要关键技术方法

研究人员以野生型C57BL/6J小鼠及Canavan病模型小鼠(Aspa^nur7/J) 新鲜冰冻脑矢状切片(10 μm) 为样本。关键技术包括：(1) 合成含邻硝基苄基叠氮的CuAAC兼容光可裂解连接子，并通过固相肽合成(solid phase peptide synthesis, SPPS) 制备C端精氨酸结尾的10-mer可变肽质量标签；(2) 对20 mer反义DNA探针利用末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) 以5-ethynyl-2′-deoxyuridine triphosphate(5-EdUTP) 进行模板非依赖的炔基尾修饰（尾长>200 nt），再与叠氮修饰肽质量标签通过CuAAC点击化学反应偶联并纯化；(3) 组织切片先喷涂2′,5′-二羟基苯乙酮(2′,5′-dihydroxyacetophenone, DHA) 基质行负离子模式非靶向脂质MALDI MSI，洗去基质后行甲醛固定、梯度乙醇处理、甲酰胺变性杂交（含质量标签探针过夜孵育）、严谨洗涤、暗处风干，经UV-A(405 nm) 照射30 min光解释放肽质量标签，重喷DHA基质行正离子模式MALDI MSI检测各基因对应肽质量标签的m/z信号；(4) 采用timsTOF fleX捕获数据，通过自定义Python脚本计算理论m/z（含光解产物、截断体及加合物），以5 ppm容差匹配实验谱图并按信号强度、无同量异位重叠等标准选取代表性光解态离子图像，使用SCiLS Lab进行均方根(root-mean-square, RMS) 归一化、T-REX特征发现及二分K均值(bisecting k-means) 空间分割与ROC分析。

三、研究结果

MALDI ISH Probe Design（MALDI ISH探针设计）

研究人员筛选了9种氨基酸（A、L、V、F、Y、D、E、S、T）避开易氧化、易形成二硫键、等重或易脱氨残基，所有肽质量标签C端固定精氨酸以增强MALDI正离子模式信号。采用"7-mer静态序列＋3-mer手动组合偶联＋N端偶联叠氮修饰邻硝基苄基连接子"的组合合成策略获得具唯一m/z的多肽标签。对每个靶基因设计3条非重叠20 mer反义DNA探针，通过TdT介导的5-EdUTP尾修饰实现多个质量标签/探针结合，起到信号放大作用，减少所需探针数并降低成本。结论：该模块化设计兼顾合成纯度、信号强度与标签多样性，3条探针 tiling策略可提升杂交稳健性。

MALDI ISH Probe Analysis（MALDI ISH探针分析）

对合成的叠氮修饰肽质量标签行MALDI点样验证及溶液相UV光解验证，确认预期o-硝基苯甲醛(o-nitrosobenzaldehyde) 及其水合/环化产物。CuAAC偶联产物经LC-MS确认，UV照射30 min时光解产物成为基峰，选定此为ISH光解时间。光解连接子产生多种linker state（如o-硝基苯甲醛[cAZL-B]、羟基苯并异恶唑[cAZL-D]、苯并恶唑啉[cAZL-G]、o-氨基苯甲醛[cAZL-I]等），均经MS/MS验证具相同氨基酸组成且空间共定位，证实源自同一肽质量标签。单重与三重(3-plex) 混合杂交对比显示信号强度与空间分布得以保持，无显著离子抑制。探针浓度梯度实验呈线性剂量—响应关系(R²=0.95)，证明半定量能力。WT小鼠脑不同个体间重复切片显示质量标签离子强度与空间模式保守。结论：探针化学性质明确，光解产物可预测，多重检测无交叉干扰，方法具良好重现性与半定量线性。

MALDI ISH in Canavan's Disease Mouse Model（Canavan病小鼠模型中的MALDI ISH应用）

对同一WT小鼠脑切片先完成负离子模式脂质成像（鉴定脂质如磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰肌醇PI等），洗基质、杂交33-plex光可裂解质量标签探针（验证其中12基因），UV光解后正离子模式检测RNA关联肽质量标签m/z。叠加显示Igfbp5（丘脑室周区）、Chrna2（弓状核）、Sla（软膜下）等典型脑区分布，与smFISH对照趋势一致。对WT与Canavan病(CD) 模型鼠脑行33-plex ISH＋脂质组学并行分析，二分K均值分割识别出胼胝体、脑干、小脑颗粒/分子层、新皮层及海马等区域。丘脑区Meis2（调控神经发生与神经元成熟的转录因子）在CD模型中信号显著降低，对应该区空泡化与结构紊乱。以Meis2定义ROI叠加脂质数据发现硫苷脂(sulfatide, SHexCer) 中SHexCer(t36:1) 在CD丘脑区异常升高，SHexCer(d40:1) 及SHexCer(t40:1) 降低，ROC得分>0.8。结论：同一组织切片上基因表达定义的ROI可精确提取区域性脂质差异，CD模型中Meis2缺失伴随少突胶质前体细胞来源的羟化脂肪酸链硫苷脂上调，提示胶质代偿反应，展示了空间多组学关联分析揭示疾病分子机制的价值。

四、讨论与结论（翻译浓缩结论部分）

研究人员开发并验证了基于MALDI ISH MSI的空间多组学方法，利用兼容SPPS的CuAAC光可裂解连接子将肽质量标签偶联至TdT尾修饰的DNA探针，可在同一10 μm新鲜冰冻组织切片上先后获取非靶向脂质组学与靶向mRNA表达图谱。该方法合成了33种光可裂解mRNA探针，在野生型及Canavan病模型小鼠脑切片上验证了12种基因的空间表达模式。平台具模块化、可扩展特性，当前实现12-plex检测，优化后有望进一步提升多重能力。方法允许以基因表达定义解剖或细胞类型ROI，比单纯形态学分区更精准关联代谢物变化。该技术框架可拓展至小分子代谢物、药物及蛋白（联合MALDI IHC），亦兼容其他电离源。未来工作将聚焦于优化光解副产物引起的额外m/z干扰及进一步提高肽质量标签合成纯度以减少同量异位重叠。此MALDI ISH MSI方法为探索转录组–代谢组相互作用及复杂疾病组织异质性提供了灵活、经济的空间多组学解决方案。