通过使用非靶向代谢组学技术和单基因敲除技术，在模式微生物大肠杆菌中解析代谢重编程过程以及基因与代谢物之间的相互作用

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Dissecting Metabolic Rewiring and Gene-Metabolite Interactions by Utilizing Untargeted Metabolomics and Single-Gene Knockouts in the Model Microorganism E. coli

　　高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片

中心碳代谢包括糖酵解、三羧酸（TCA）循环和戊糖磷酸途径（PPP），对大肠杆菌的生存和生长至关重要。虽然已知这些途径的紊乱会影响细胞生理，但单基因敲除对整个系统代谢水平的影响仍不完全清楚。通过使用非靶向LC-MS代谢组学方法，我们系统地分析了TCA核心酶、异构体、亚基、旁路途径及TCA相关途径的大肠杆菌敲除体。TCA核心基因敲除体分为两个主要的代谢簇：簇1的菌株在氨基酸代谢方面表现出显著差异，而簇2的菌株与亲本菌株仍有一定的相似性。异构体特异性缺失揭示了乌头酸酶（ΔacnA vs ΔacnB）和延胡索酸酶（ΔfumA vs ΔfumC）的不同作用；2-氧戊二酸脱氢酶（ΔsucA, ΔsucB）和琥珀酸脱氢酶（ΔsdhA-D）的亚基缺失导致了局部但明显的代谢变化，尤其是在谷氨酸和2-氧戊二酸相关的代谢过程中。旁路酶的缺失（ΔaceA, ΔaceB, ΔglcB, ΔmaeB）扰乱了碳水化合物和氧化还原相关的代谢途径，突显了它们作为代谢安全网的作用。重要的是，这些敲除还引发了糖酵解、PPP和电子传递链的脱靶效应，表明中心碳代谢的相互关联性。我们的系统方法证明了利用全面和非靶向代谢组学来绘制基因-代谢关联图谱并解码潜在代谢联系的可能性。

**特刊**
本文发表于《美国质谱学会杂志》（Journal of the American Society for Mass Spectrometry）的“微生物科学中的质谱技术”（Mass Spectrometry in Microbial Sciences）特刊中。

**1. 引言**
像大肠杆菌（E. coli）中的中心碳代谢这样的主要代谢途径非常稳健，整合了三羧酸循环（TCA）、糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径（PPP）和电子传递链（ETC），以支持能量产生、生物合成和氧化还原平衡。(1,2) TCA循环是这一网络的核心，它为氧化磷酸化生成还原当量，并为氨基酸、核苷酸和辅因子的生物合成提供前体。(3) 重要的是，该循环不是一个封闭的循环，而是由旁路途径（如乙醛酸支路和苹果酸酶介导的旁路）补充，在应激或遗传扰动下提供代谢灵活性。(4,5) 单基因敲除在探究微生物的代谢功能和可塑性方面发挥了重要作用。使用Keio Collection（一个系统性的大肠杆菌单基因缺失库）的研究表明，即使是非必需基因的敲除也能诱导全局代谢重编程，并触发中心代谢的补偿性流动。(6) 在许多情况下，多酶复合体中的异构体或亚基特异性基因缺失会导致细微或独特的表型，反映了部分冗余性和流动的分布式控制。(7,8) 例如，大肠杆菌编码多种乌头酸酶（AcnA/B）和延胡索酸酶（FumA/B/C）异构体，这些异构体根据环境和细胞状态对TCA活性的贡献不同。

尽管TCA循环酶的直接作用已经得到充分研究，但其敲除对更广泛代谢水平的影响仍待探索。敲除可能会通过代谢物积累、氧化还原失衡或全局调控反应在相互关联的途径（如PPP、糖酵解和ETC）中产生脱靶效应。(6) 这些次要效应难以预测，但它们为细菌代谢的可塑性和适应性提供了关键见解。非靶向代谢组学提供了一种强大的方法来捕捉这些系统范围的代谢变化，有助于发现隐藏的表型并揭示代谢韧性的机制。

在这里，我们使用大肠杆菌中的单基因敲除作为模型系统，展示了非靶向代谢组学如何揭示由TCA循环及其相关途径中酶的缺失引起的意外和先前未报告的代谢变化。通过系统地分析这些敲除突变体，我们发现了不同的代谢重联模式、意外的代谢变化以及超出经典途径注释的隐藏网络关联。除了推进对代谢稳健性的基本理解外，这些发现对于合成生物学和代谢工程也具有直接意义，因为它们可以识别出在受到干扰时表现出高缓冲能力的代谢节点与那些导致广泛网络重组的节点。这样的基因-代谢图谱为预测脱靶效应、优化流量重新分配和提高工程微生物系统的稳健性提供了数据驱动的框架。

**2. 材料与方法**
2.1. 化学试剂和细菌培养用品
用于培养大肠杆菌的LB（溶原菌肉汤）琼脂和LB肉汤培养基购自Fisher Scientific（美国新罕布什尔州汉普顿）。用于培养和代谢物提取的培养皿、锥形管和无菌Eppendorf管也来自Fisher Scientific。用于抗生素筛选的卡那霉素购自MilliporeSigma（美国马萨诸塞州伯灵顿）。

2.2. 在含卡那霉素的LB肉汤中培养大肠杆菌
90种大肠杆菌Keio敲除菌株及其相应的野生型亲本菌株来自Horizon Discovery（英国剑桥）。培养时，使用20 g/L的低盐LB培养基溶解在920 mL去离子水中配制LB肉汤，并加入卡那霉素至最终浓度25 μg/mL。培养基在121°C下高压灭菌25分钟。

2.3. 从LB肉汤中提取代谢物
将冷冻的大肠杆菌菌株划线接种到LB琼脂平板上复苏。培养后，分离单个菌落并在LB肉汤中过夜培养。每个实验准备四个生物学重复样本。将100 μL过夜培养物转移到含有10 mL新鲜LB肉汤（添加卡那霉素）的15 mL锥形管中。培养物在37°C下有氧培养24小时。培养和OD测试后，将1 mL细菌悬浮液转移到无菌Eppendorf管中。野生型亲本菌株在不含卡那霉素的LB肉汤中培养，作为基线对照。未接种细菌的LB肉汤作为阴性对照。

2.4. 从大肠杆菌培养物中提取代谢物
将储存在无菌微量离心管中的细菌培养物在4°C下以14,000 rpm的速度离心10分钟，使用Thermo Scientific Sorvall ST 8离心机。细菌沉淀物（细胞内部分）用500 μL DPBS洗涤三次。每次洗涤后，通过上下吸移确保沉淀物充分接触缓冲液，然后再次以14,000 rpm的速度离心10分钟。每次洗涤后弃去上清液。加入250 μL甲醇提取极性代谢物，随后加入50 μL稳定同位素标记的氨基酸混合物（作为内标），混合液涡旋2分钟。样品置于-20°C下20分钟以促进代谢物沉淀。冷却后，再次以14,000 rpm的速度离心20分钟。将150 μL上清液转移到新的无菌1.5 mL微量离心管中，并使用SpeedVac浓缩器在30°C下干燥约1.5小时。干燥后的提取物用200 μL 50%乙腈（v/v，乙腈：去离子水 = 1:1）复溶，涡旋2分钟，然后转移到玻璃LC小瓶中。每个样品取10 μL样本合并到一个单独的玻璃小瓶中，作为极性代谢物分析的质量控制（QC）样本。

2.5. 数据采集、处理和统计分析
本研究采用的非靶向代谢组学工作流程已在先前详细描述。(9) 使用Thermo Vanquish超高效液相色谱（UPLC）系统（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）与混合四极杆-轨道阱质谱仪（Q Exactive Plus，Thermo Fisher Scientific）联用进行代谢物分析。色谱分离使用XBridge BEH Amide柱（2.5 μm，2.1 × 150 mm；Waters，美国马萨诸塞州米尔福德）进行，该柱子针对极性代谢物的保留进行了优化。

原始LC-MS光谱数据使用Compound Discoverer（版本3.3，Thermo Fisher Scientific）进行处理，包括峰检测、保留时间对齐、特征整合和代谢物注释。未鉴定出代谢物的特征被排除在进一步分析之外。代谢物注释基于内部光谱库（mzCloud、mzVault和MassList），这些库使用在相同色谱和质谱条件下分析的真实化学标准进行了验证。相对定量基于提取的离子色谱图的积分峰面积进行。信号强度根据内部标准和细菌培养的光学密度进行归一化，以考虑分析变异性和生物量差异。代谢物测量在生物学重复样本中进行评估，仅保留检测一致且分析重复性可接受的特征。具体来说，保留了在合并的质量控制（QC）样本中变异系数（CV）< 30%的注释代谢物。去除重复注释后，最终代谢物列表用于下游统计分析。

使用Student’s t检验（p < 0.05）进行单变量统计分析，以识别基因敲除菌株与亲本菌株之间显著改变的代谢物。进行多变量分析，包括主成分分析（PCA）和层次聚类（PCA），以评估与基因缺失相关的全球代谢变化。使用MetaboAnalyst（版本6.0）中的KEGG通路富集分析对显著改变的代谢物进行功能解释。数据可视化和额外统计分析使用MetaboAnalyst 6.0和GraphPad Prism（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行。

**3. 结果**
3.1. 大肠杆菌中TCA相关基因缺失的代谢谱分析
进行了全面的非靶向代谢组学分析，以研究针对TCA循环、TCA旁路及相关途径的大肠杆菌单基因敲除的代谢后果。关于代谢物覆盖范围、分析变异性和生物学重复样本间可重复性的详细信息见补充图1。共鉴定出73种高置信度代谢物，涵盖多种化合物类别，包括氨基酸、核苷/核苷酸、碳水化合物和有机酸（补充图1a）。CV值的分布证实了数据集的高可重复性（补充图1b）。PCA显示亲本菌株与TCA相关敲除菌株之间存在明显的分群，表明单基因缺失会导致全局代谢变化（补充图2a）。

3.2. TCA循环核心酶敲除诱导不同的代谢簇
所有报告的代谢物变化均表示来自生物学重复样本间标准化LC-MS峰强度的相对丰度差异。接下来，通过PCA可视化亲本菌株与携带关键TCA循环酶缺失的菌株之间的全球代谢差异。TCA循环核心基因的敲除形成了两个不同的代谢簇。簇1包括ΔacnA、ΔfumA、ΔfumC、Δmdh和Δicd突变体，与亲本菌株有明显分离（图1a）。在这个组中，ΔacnA、ΔfumA、ΔfumC和Δicd突变体被定义为亚簇1（图1b）。PC1分别占两个独立分析总方差的80.9%和47.5%，表明相对于亲本菌株，代谢组成发生了显著变化。簇2包括ΔacnB、ΔsucA、ΔsucB、ΔsucC、ΔsdhA、ΔsdhB、ΔsdhC和ΔsdhD突变体，与亲本菌株有部分重叠，表明代谢重编程较为温和（图1d,e）。

**图1**
图1. 亲本菌株与TCA核心酶敲除菌株之间的代谢谱比较，以及亚簇特征。（a）比较亲本菌株与一组敲除菌株（簇1）的PCA图。（b）显示簇1内敲除菌株间变异的PCA图。（c）基于ANOVA（FDR调整后的p < 0.05）和投影变量重要性（VIP）得分>1的簇1中显著改变的化合物类别分布。（d）比较亲本菌株与其紧密相关的敲除菌株（簇2）的PCA图。（e）排除亲本菌株的簇2内敲除菌株间的变异的PCA图。（f）基于相同统计标准的簇2中显著代谢物的化合物类别分布。

**高分辨率图像**
下载MS PowerPoint幻灯片

使用FDR调整后的p值和投影变量重要性（VIP）得分>1，将亲本菌株与菌株间有显著差异的代谢物分类为主要的生化类别。这些类别包括氨基酸、碳水化合物和核苷酸相关的代谢物。在簇1中，改变最多的代谢物是核苷、核苷酸及其衍生物（18种化合物），其次是氨基酸和肽类似物（12种化合物）以及碳水化合物结合物（12种化合物；图1c）。亚簇1中显著改变的代谢物数量明显减少。相比之下，簇2在类别分布上更为平衡，有5种氨基酸和肽相关代谢物、6种碳水化合物结合物以及6种核苷酸和核苷酸相关化合物（图1f）。在亚群2中排除母本菌株后，每个类别中的代谢物数量仅发生了轻微变化。补充图2b–f.3.3中的热图展示了簇1、亚群1、簇2和亚群2之间代谢物强度变化的全面比较。TCA酶的异构体特异性和亚基特异性敲除揭示了不同的重编程现象。有趣的是，异构体特异性敲除分析还表明，删除乌头酸酶异构体（ΔacnA和ΔacnB）和延胡索酸酶异构体（ΔfumA和ΔfumC）可以产生不同的代谢谱型（图2）。PCA分析显示ΔacnB与ΔacnA相比有更大的差异（图2a），而ΔfumA和ΔfumC与母本菌株有部分重叠（图2c）。代谢物峰值强度的比较突出了乌头酸酶异构体之间的特异性扰动（图2b；补充图3）。葡萄糖-6-磷酸（G6P）、果糖赖氨酸、脂酰胺和尿苷-5′-三磷酸（UTP）的峰值强度在母本菌株和延胡索酸酶异构体之间存在显著差异（图2d）。全面的代谢物分析显示，多个途径发生了显著变化，包括嘧啶和嘌呤代谢、精氨酸生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，如补充图4 a–d所示。

在亚群2中排除母本菌株后，每个类别中的代谢物数量仅发生了轻微变化。补充图2b–f.3.3中的热图展示了簇1、亚群1、簇2和亚群2之间代谢物强度变化的全面比较。TCA酶的异构体特异性和亚基特异性敲除揭示了不同的重编程现象。有趣的是，异构体特异性敲除分析还表明，删除乌头酸酶异构体（ΔacnA和ΔacnB）和延胡索酸酶异构体（ΔfumA和ΔfumC）可以产生不同的代谢谱型（图2）。PCA分析显示ΔacnB与ΔacnA相比有更大的差异（图2a），而ΔfumA和ΔfumC与母本菌株有部分重叠（图2c）。代谢物峰值强度的比较突出了乌头酸酶异构体之间的特异性扰动（图2b；补充图3）。葡萄糖-6-磷酸（G6P）、果糖赖氨酸、脂酰胺和尿苷-5′-三磷酸（UTP）的峰值强度在母本菌株和延胡索酸酶异构体之间存在显著差异（图2d）。全面的代谢物分析显示，多个途径发生了显著变化，包括嘧啶和嘌呤代谢、精氨酸生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，如补充图4 a–d所示。

2-氧代戊二酸脱氢酶（ΔsucA和ΔsucB）和琥珀酸脱氢酶（ΔsdhA–D）单个亚基的敲除导致了可测量且明显的代谢改变（图3a–d）。PCA分析显示ΔsucA和ΔsucB与母本菌株有部分分离（图3a），代表性代谢物显示出依赖于异构体和亚基的强度变化（图3b）。同样，琥珀酸脱氢酶亚基的敲除产生了异质但可检测到的变化，表明单个亚基的破坏会引发局部代谢扰动，而不是全局性的重路由（图3c–d；补充图4 e-h）。尽管峰值强度发生了变化，我们的数据在ΔsucA/ΔsucB比较中发现了烟酸和烟酰胺代谢的变化（补充图4f），但在ΔsdhA–D比较中没有发现显著改变的途径（补充图4h）。

同时，我们观察到与TCA循环功能相关的苹果酸脱氢酶（Δmdh）和苹果酸：醌氧化还原酶（Δmqo）的删除导致了与母本菌株明显的代谢差异，PCA图显示了这一点（图4a）。这两种敲除都显著影响了与中心碳代谢和氧化还原平衡相关的途径，代表性代谢物涵盖了氨基酸、核苷酸和碳水化合物衍生物（图4b–c；补充图5）。

此外，甘油酸旁路酶（ΔaceA、ΔaceB和ΔglcB）以及苹果酸酶（ΔmaeB）的敲除也显示出与母本菌株的显著代谢差异（图5a–f）。这些代谢谱型在ΔaceA、ΔaceB、ΔglcB之间没有显著差异，只有dUMP的峰值强度在ΔaceA和ΔglcB之间有统计学差异（图5c；补充图6a-b）。与母本菌株相比，ΔmaeB主要改变了碳水化合物和氨基酸类（图5f；补充图6c-d）。这些结果表明，在基因中断的情况下，旁路途径为代谢物分布和氧化还原平衡提供了灵活性。

为了进一步评估非靶向效应和网络级效应，我们分析了参与PPP（8个突变体）、ETC（16个突变体）和糖酵解/糖异生（9个突变体）的酶的敲除。PCA、途径分析和热图可视化显示，这些与TCA循环相邻的途径的扰动广泛传播到中心代谢，影响了多个代谢物类别（图6）。

对PPP敲除的全面代谢物分析显示，核苷酸和糖磷酸代谢发生了显著变化。差异丰富的代谢物包括嘌呤和嘧啶核苷酸，如三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸尿苷（UTP）、单磷酸胞苷（CMP）、单磷酸鸟苷（GMP）、2′-脱氧鸟苷单磷酸（dGMP）和脱氧尿苷单磷酸（dUMP）。在糖磷酸中间体中也观察到了变化，包括核糖-5-磷酸（R5P）、葡萄糖-6-磷酸（G6P）和庚酮糖-7-磷酸（S7P）。ETC敲除主要影响了与氧化还原相关的代谢物，包括黄素类物质如核黄素（维生素B2）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN），以及烟酰胺辅因子，包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）及其还原形式（NADH）。此外，还检测到了与细胞氧化还原平衡相关的代谢物变化，包括泛酸（维生素B5）、脂酰胺和S-乳酰谷胱甘肽（SLG）。

对PPP敲除的全面代谢物分析显示，核苷酸和糖磷酸代谢发生了显著变化。差异丰富的代谢物包括嘌呤和嘧啶核苷酸，如三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸尿苷（UTP）、单磷酸胞苷（CMP）、单磷酸鸟苷（GMP）、2′-脱氧鸟苷单磷酸（dGMP）和脱氧尿苷单磷酸（dUMP）。在糖磷酸中间体中也观察到了变化，包括核糖-5-磷酸（R5P）、葡萄糖-6-磷酸（G6P）和庚酮糖-7-磷酸（S7P）。ETC敲除主要影响了与氧化还原相关的代谢物，包括黄素类物质如核黄素（维生素B2）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN），以及烟酰胺辅因子，包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）及其还原形式（NADH）。此外，还检测到了与细胞氧化还原平衡相关的代谢物变化，包括泛酸（维生素B5）、脂酰胺和S-乳酰谷胱甘肽（SLG）。

影响糖酵解和糖异生的敲除导致碳水化合物和氨基酸代谢的广泛变化。关键碳水化合物中间体的丰度发生了变化，包括G6P、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、R5P和UDP-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）。在氨基酸方面，观察到l-天冬氨酸（Asp）、l-谷氨酸（Glu）和谷胱甘肽氧化还原对（GSH/GSSG）的变化。

在这项研究中，非靶向代谢组学分析表明，在大肠杆菌中敲除核心TCA循环酶会导致显著的代谢重路由，证明了该网络在遗传扰动下维持代谢功能的灵活性。将敲除菌株聚类为不同的代谢谱型（图1）表明，补偿机制根据被破坏的酶的不同而有所不同。与野生型偏差最大的簇1菌株可能依赖于替代途径，如甘油酸旁路或苹果酸酶旁路（图5）来维持碳流。相比之下，与母本菌株在代谢上更接近的簇2敲除可能保留了部分TCA功能或使用了破坏性较小的旁路途径。

对于观察到的簇特异性反应的一个合理机制解释是，旁路途径的参与反映了在酶破坏后保持关键代谢约束的需求，包括碳保存、氧化还原平衡和异化途径的流动。破坏脱羧步骤或必需TCA中间体生成的敲除可能优先激活甘油酸旁路，以最小化碳损失，同时维持乙酰辅酶A的利用；而限制氧化流动或氧化还原耦合的扰动可能倾向于利用苹果酸酶介导的旁路来重新平衡细胞NAD(P)H池。与此框架一致的是，在ΔacnA、Δicd、Δmdh、ΔfumA和ΔfumC突变体中观察到了旁路途径的激活。

相比之下，保留部分TCA功能或有效调节补偿的敲除可能依赖于破坏性较小的重路由，导致代谢谱型更接近母本菌株。观察到ΔacnB、ΔsucA–C和ΔsdhA–D敲除在代谢上与野生型相似，可能反映了在营养丰富条件下的中心代谢的缓冲能力。在LB培养基中生长可以减少对完整氧化TCA循环的依赖，通过提供丰富的氨基酸和替代碳源，从而通过异化反应和途径冗余实现补偿。此外，在有氧条件下，AcnB与AcnA表现出部分功能冗余；而2-氧代戊二酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶复合体的扰动可能更倾向于影响呼吸耦合，而不是碳流本身。

对于异构体特异性敲除的差异代谢后果与大肠杆菌中已建立的调节和应激反应机制一致。乌头酸酶异构体acnA和acnB受到氧化应激和铁可用性的不同调节，acnA在应激条件和静止期优先表达，而acnB主要在有氧指数生长期间发挥作用。此外，AcnB的[4Fe–4S]簇在氧化应激或低铁条件下会不稳定，导致酶活性丧失。因此，acnA的破坏可能会损害应激适应能力和氧化还原感应，导致比acnB删除更明显的代谢扰动。相比之下，fumA的删除导致的代谢变化与fumC观察到的变化相似。尽管fumA在有氧条件下编码主要的延胡索酸酶，并且对氧化应激和铁限制敏感，而fumC的丰度较低但更耐氧化损伤，但相似的代谢谱型表明在所使用的生长条件下存在显著的功能缓冲。LB培养基中缺乏强烈的氧化应激、潜在的旁路途径参与以及fumase异构体之间的补偿调节可能共同限制了删除任一基因的代谢后果。这些观察结果强调了即使表面上冗余的异构酶也可能表现出依赖于上下文的功能重叠，使得预测单基因扰动后的代谢结果变得复杂。

2-氧代戊二酸脱氢酶（sucA、sucB）和琥珀酸脱氢酶（sdhA–D）亚基删除的差异代谢后果揭示了多酶复合体的模块化。sdhC和sdhD的敲除损害了琥珀酸脱氢酶的醌结合亚基，导致琥珀酸和琥珀酰精氨酸的积累存在差异但明显，这与它们在连接TCA循环和ETC中的作用一致。这些观察结果强调了并非所有亚基对代谢流的贡献都是相同的，有些亚基在调节或结构上起着更重要的作用。直接检测2-氧代戊二酸及其相关上下游代谢物将提供更强的证据，证明琥珀酸亚基在调节2-氧代戊二酸转化为琥珀酰辅酶A中的作用。

在TCA循环中断时激活旁路途径，如甘油酸旁路（aceA、aceB、glcB）和苹果酸酶（maeB），展示了大肠杆菌的代谢灵活性。甘油酸旁路途径可以绕过TCA循环中的两个脱羧步骤，在产生琥珀酸的酶（例如Δsdh突变体）受损时，对于维持碳流似乎至关重要。这与先前的研究结果一致，这些研究表明在碳限制条件下，aceA和aceB的表达会增加。(21,22) 同时，maeB敲除对碳水化合物代谢的影响（图5f）表明，苹果酸酶作为一个关键的补偿节点，在TCA循环受损时能够补充丙酮酸并支持糖异生。在PPP、ETC和糖酵解/糖异生敲除中观察到的更广泛的代谢网络扰动（图6）突显了中心代谢的相互关联性。例如，PPP的破坏改变了核苷酸池（图6c），这可能是由于用于核苷酸合成的戊糖前体减少所致。同样，ETC的敲除影响了氧化还原敏感的代谢物（图6f），这与它们在维持NAD+/NADH平衡中的作用一致。强烈的糖酵解/糖异生变化（图6i）进一步表明，碳流会动态地重新分配以应对TCA循环的功能障碍，可能是为了通过底物水平的磷酸化来维持ATP的产生。(23,24) 图7概念性地总结了TCA相关基因敲除后观察到的特定簇的代谢重编程，强调了旁路途径的激活、在LB条件下的缓冲作用以及从非靶向代谢组学中推断出的主要代谢物类别的变化。

图7. TCA相关基因敲除在大肠杆菌中诱导的代谢重编程的总结示意图。非靶向代谢组学揭示了两种主要的代谢响应模式：第1簇的敲除表现出适应性响应，其特征是旁路途径的激活以及核苷酸、氨基酸和碳水化合物代谢的协调变化；而第2簇的敲除在LB条件下仍然保持代谢缓冲。箭头和注释基于稳态代谢物变化而非直接流量测量来指示可能的途径参与。

我们的发现对代谢工程和合成生物学具有重要意义。首先，它们表明由于代谢网络的灵活性，基因敲除可能会产生不可预测的脱靶效应。例如，试图通过阻断TCA循环来增加琥珀酸的产生（例如Δsdh敲除）可能会无意中激活旁路途径，如甘油酸旁路途径，从而改变预期的产物谱型。其次，同源物和亚基缺失的菌株特异性效应表明，精确的途径操作需要详细了解酶的动力学和调控相互作用。尽管这项研究提供了对TCA循环基因敲除后代谢响应的全面视图，但仍存在一些局限性，这也指出了未来工作的机会。首先，所有实验都是在LB培养基的有氧条件下进行的；在最小培养基或厌氧环境等替代生长条件下，代谢响应可能会有显著差异。其次，虽然非靶向代谢组学能够广泛覆盖代谢变化，但它并未直接测量代谢流量，也不适合检测几种关键的TCA循环中间体（例如柠檬酸、2-氧戊二酸和琥珀酰辅酶A）。因此，这里描述的代谢重编程和补偿反应是基于稳态代谢物丰度的变化推断出来的，而不是通过定量验证的流量重新分配。未来的研究将整合靶向代谢组学、稳定同位素追踪和流量分析，并理想地结合转录组学或蛋白质组学测量，这对于直接量化途径流量、验证推断的重编程机制以及揭示本研究中未捕捉到的调控过程至关重要。

5. 结论

这项系统的非靶向代谢组学研究表明，大肠杆菌中心碳代谢中的单基因敲除会触发广泛而具体的代谢重编程，揭示了该网络的固有可塑性。我们确定了两个具有不同补偿特征的核心酶敲除簇，并表明同源物和亚基特异性缺失会产生不同的代谢结果，突显了超出经典途径的精细调控。旁路途径的激活以及糖酵解、PPP和ETC中的显著脱靶效应强调了中心代谢的深度互连性。这项工作证明了非靶向代谢组学作为发现工具的力量，可以解码复杂的基因-代谢物相互作用并揭示隐藏的代谢联系。对大肠杆菌代谢的韧性和适应性的见解为未来的功能基因组学和代谢工程提供了宝贵的框架，在这些领域中，预测和管理基因修饰的系统性后果至关重要。未来结合靶向流量分析和多组学方法的研究将对于完全量化重新分配的代谢流并阐明控制这种显著网络可塑性的潜在调控机制至关重要。