血浆蛋白质组学中无血小板血浆耗竭与富集技术的系统评估

《Journal of Proteome Research》：Systematic Evaluation of Depletion and Enrichment Technologies for Platelet-Free Plasma Proteomics

　　

血浆蛋白质组学是一种快速、无创且信息丰富的方法，用于识别疾病生物标志物。然而，蛋白质浓度的宽动态范围限制了液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）蛋白质组学的深度。为了解决这一挑战，研究人员利用Orbitrap Astral仪器和DIA（Data-Independent Acquisition）技术，评估了多种蛋白质耗竭和富集技术在无血小板血浆上的性能。具体而言，研究人员评估了：高氯酸（PCA_N）耗竭、免疫耗竭（Immunodepletion）、ProteoMiner、MagNet-SAX、ENRICHplus、Proteonano以及ProteoMiner与免疫耗竭的组合（PM+ID）。所有方法均从蛋白质组深度、蛋白质定量精密度和功能分析等方面进行了评估。Proteonano对最低丰度蛋白质表现出最有效的富集，置信鉴定了299种图谱血液浓度低于106pg/L的蛋白质。免疫耗竭在中丰度范围（660种置信蛋白质）产生了最高的蛋白质组覆盖率。此外，ENRICHplus的定量谱与原始血浆（Neat plasma）高度匹配（93%相关性）。MagNet-SAX（13%）、ProteoMiner（15%）和免疫耗竭（16%）也展示了高重复性（中位数变异系数CV）。结合ProteoMiner和免疫耗竭降低了血浆蛋白质动态范围，实现了更深度的低丰度蛋白质分析，但降低了重复性。这些在无血小板血浆上获得的结果与此前在富血小板血浆上的报告结果存在差异，凸显了血浆蛋白质组学中关键的样品制备阶段的重要性。

论文解读：无血小板血浆蛋白质组学前处理技术的系统基准测试

研究背景与意义

人血浆因其微创采集和高信息量的特点，是发现疾病生物标志物的宝贵资源。然而，血浆蛋白质组面临着极端复杂的挑战，其蛋白质浓度跨度超过12个数量级，其中约20种高丰度蛋白（如白蛋白、免疫球蛋白）占据了总蛋白含量的99%，严重掩盖了低丰度蛋白质的检出，限制了液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）的检测深度。此外，血小板在血浆制备过程中的体外活化会释放蛋白质和细胞外囊泡（EVs），导致样本污染和分析偏差。尽管已有多种蛋白质耗竭、均衡化和富集策略被开发出来，但既往研究多基于低速离心制备的含血小板血浆，且缺乏对血小板残留影响的系统评估。因此，本研究旨在通过对无血小板血浆进行严格的双离心处理，系统性地基准测试七种主流工作流程，以期为血浆蛋白质组学研究提供更可靠的样本前处理指南。该研究成果发表于《Journal of Proteome Research》。

关键技术方法

研究人员采集健康成人外周血，通过两次2000 g、10分钟的离心步骤制备无血小板血浆，并利用Baize软件确认了极低的血小板污染指数。随后，研究人员应用了六种富集/耗竭工作流程（PCA_N、免疫耗竭、ProteoMiner、MagNet-SAX、ENRICHplus、Proteonano）及两者的组合（PM+ID），每种方法设三个技术重复。样本经处理后，采用Orbitrap Astral质谱仪结合数据非依赖采集（DIA）模式进行分析。数据处理使用DIA-NN软件配合UniProtKB/Swiss-Prot人类数据库进行检索，并通过R语言和多种生物信息学工具进行统计学分析和功能注释。

研究结果

1. 无血小板血浆中鉴定到的肽段和蛋白质组

在七种方法中，大多数方法鉴定到的肽段和蛋白质数量均优于原始血浆。Proteonano显著增加了蛋白质组覆盖率（2.1倍），鉴定到15,504 ± 531条肽段和1955 ± 29个蛋白质组，位居榜首。免疫耗竭紧随其后，鉴定到1747 ± 16个蛋白质组。相比之下，PCA_N并未显著增加蛋白质组数量。在“置信蛋白质”（在所有重复中稳定检出且CV<30%）的分析中，免疫耗竭、Proteonano和PM+ID分别鉴定到1246、1118和829种置信蛋白质，远超原始血浆的639种。

2. 鉴定蛋白质的功能分析

基因本体（GO）分子功能富集分析显示，免疫耗竭独特鉴定的蛋白质主要与催化活性相关，而PCA_N和Proteonano独特鉴定的蛋白质则主要涉及蛋白结合和信号传导功能。在功能覆盖面上，Proteonano和免疫耗竭对细胞外囊泡（EV）相关蛋白的富集倍数最高（约为原始血浆的2倍）。此外，Proteonano还显著富集了血小板活化相关蛋白和G蛋白功能相关蛋白，表明其在捕获特定信号通路蛋白方面的优势。

3. 血浆蛋白质组分析的动态范围

通过将鉴定到的蛋白质映射至人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）中的已知血液浓度，研究人员评估了各方法的动态范围。在极低丰度蛋白（<10⁶pg/L）的检出方面，Proteonano表现最佳，鉴定到490种此类蛋白，其中299种为置信蛋白质。在中丰度蛋白（10⁶–10⁸pg/L）范围内，免疫耗竭覆盖了最多的蛋白质（820种）。这表明不同技术针对不同丰度区间的蛋白质具有互补性。

4. 蛋白质富集与精密度评估

精密度评估显示，MagNet-SAX的中位数CV最低（13%），其次是ProteoMiner（15%）和免疫耗竭（16%）。PM+ID和PCA_N的精密度相对较低。在富集因子分析中，免疫耗竭对高丰度蛋白表现出显著的耗竭作用（高达10倍的对数尺度降低），而Proteonano则显示出对中等丰度蛋白的不一致行为（既有富集也有耗竭）。

5. 不同方法间蛋白质定量的成对相关性与分布

成对Pearson相关性分析表明，ENRICHplus的定量谱与原始血浆最接近（93%相关性），其次是PM+ID（90%）和免疫耗竭（89%）。PCA_N与其他工作流程的相关性最弱，表明其诱导了较大的定量偏差。

6. Proteonano偶联肽在胰蛋白酶消化过程中的稳定性

针对Proteonano磁珠上偶联的三种肽段可能在胰蛋白酶消化过程中被切割的疑虑，研究人员通过BLASTp比对和DIA-NN靶向检索证实，这些偶联肽段在消化过程中保持稳定，未被释放或检测到，排除了其对人类蛋白质组鉴定的干扰。

讨论与结论总结

本研究系统评估了应用于无血小板血浆的多种蛋白质耗竭与富集技术。研究结果表明，所有评估的技术均能有效压缩血浆蛋白质组的动态范围，从而实现更深度的蛋白质分析。其中，Proteonano和免疫耗竭分别针对低丰度和中等丰度蛋白质取得了最佳结果，而MagNet-SAX则展示了最高的精密度。值得注意的是，ProteoMiner与免疫耗竭的联合使用虽然加深了分析深度，但以牺牲通量和重复性为代价。此外，本研究强调了血浆制备方案（特别是离心速度和次数）对蛋白质组学结果的显著影响，解释了为何本研究结果与既往基于富血小板血浆的研究存在差异。研究人员建议，在将此类工作流程应用于未经评估的血浆制备协议时，应进行初步测试。未来的工作应致力于标准化血浆制备流程，以增强富集技术的可重复性和可比性。