综述：作物基因激活编辑技术的研究进展与应用

《Frontiers in Plant Science》：Research progress and applications of gene activation editing technology in crops

　　

近年来，CRISPR/Cas基因编辑技术已成为生物育种的基础方法。作为一种克服技术障碍的重要工具，它目前广泛应用于多种生物的功能基因研究和遗传改良。目前，基于dCas9融合转录激活结构域的CRISPR激活(CRISPRa)技术已成为扩大CRISPR/Cas系统在植物、动物和微生物性状改良中应用的有力工具。本综述首先回顾了基因激活编辑技术的原理和组成部分，以及其三代技术的发展阶段。在重点关注基因激活编辑在作物重要性状（包括生长发育调控、抗逆性和品质调控）应用的同时，总结了该领域目前的困难和潜在方向。旨在为作物育种的研究与开发提供有价值的见解。

1 引言

基因组编辑是一项能够精确且特异地改变生物体基因组的革命性技术。随着基因工程的快速发展，基因编辑技术已从锌指核酸(ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)演变为基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)的CRISPR/Cas系统。其中，CRISPR/Cas系统凭借其设计简单、操作高效和强大的编辑能力，迅速成为增强微生物、动物和植物特性的重要工具。通过对功能元件的优化和修饰，利用CRISPR/Cas系统已开发出多种强效的基因编辑和调控工具，包括碱基编辑器(BE)、引物编辑器(PE)、基于CRISPR的基因表达抑制系统(CRISPRi)和基于CRISPR的基因表达激活系统(CRISPRa)，显著扩展了基因组编辑的应用范围。尽管CRISPRa等调控技术在增强作物性状方面具有相当大的前景，但在激活效率、靶向精度和脱靶风险管理方面仍面临重大障碍。随着测序技术、DNA合成技术和AI辅助设计的深度融合，基因调控编辑的精度和可靠性有望得到系统性提升。本研究系统综述了基于CRISPR/Cas的基因激活调控技术的发展及其在改善作物重要农艺性状中的应用，并概述了该技术的未来方向，旨在为作物分子设计育种提供理论参考和技术见解。

2 基因激活编辑技术的原理与组成

CRISPR激活(CRISPRa)是一种基于失活Cas蛋白(dCas)的转录调控技术。该方法通过将转录激活结构域融合到dCas蛋白上，创建dCas-激活剂复合物。该复合物在sgRNA的引导下精确靶向目标基因的启动子或增强子区域，通过招募和稳定转录起始复合物，实现目标基因表达的上调。整个过程既不引入遗传序列改变，也不产生DNA双链断裂。CRISPRa主要由以下要素组成，并已广泛应用于转录调控：

2.1 dCas蛋白

靶向突变重要的核酸酶结构域会导致dCas蛋白（Cas蛋白的变体）失去切割DNA的能力。通过改变保守的RuvC和HNH核酸酶结构域，Cas蛋白在gRNA引导下能够保持结合DNA的能力，同时丧失切割功能。RuvC结构域负责切割非靶标链，D10A是常见的失活突变；HNH结构域负责切割靶标链，H840A是典型的失活突变。Qi等人将双突变(D10A/H840A)引入化脓链球菌Cas9核酸酶，发现DNA切割活性被完全消除，形成了dCas9。目前的多数研究使用dCas9蛋白，但已有研究表明失活的Cas12f1蛋白可与转录激活结构域TV融合，共同激活水稻OsIPA1的表达。在特异性结合靶标DNA序列方面，dCas的PAM识别机制与野生型Cas蛋白相同。

2.2 gRNA

天然gRNA由两部分组成：靶标特异性的crRNA和辅助的反式激活crRNA(tracrRNA)。Charpentier和Doudna将crRNA和tracrRNA的互补区域融合，创建了单向导RNA(sgRNA)。sgRNA增强了Cas9活性。目前可用的工程化sgRNA序列长约96个核苷酸，由一个人工四环、一个20-nt的靶标互补序列（间隔区）和一个包含五个二级结构模块（下茎、上茎、凸起、连接点和发夹）的支架序列组成。gRNA在CRISPRa中具有三个作用：特异性靶向：通过间隔区序列识别并结合靶标启动子/增强子区域；招募dCas-激活剂复合物：定位与转录激活结构域偶联的dCas蛋白；转录稳定化支持机制：一些工程化gRNA可额外招募转录因子。因此，工程化gRNA可有效提高CRISPRa系统的效率，实现对基因表达的精确调控。目前，最大化CRISPR/Cas9系统功能的常见方法之一是修饰gRNA间隔区序列。间隔区序列负责识别靶标DNA并具有独特的二级结构，gRNA二级结构改变多种CRISPR系统活性的能力为特异性优化研究提供了重要方向。为Cas12f设计并优化环状gRNA可大大提高小鼠体内的基因激活效率，提升幅度约为1.9至19.2倍。通过在支架中插入RNA适配器（如MS2、PP7）以招募额外的激活剂（如MS2-VP64），可极大地提高激活效力。gRNA的长度和靶位点选择也影响CRISPRa系统的有效性。Kiani等人发现，当使用10-20nt的sgRNA引导序列时，dCas9-VPR融合蛋白可有效进行转录激活；然而，当引导序列长度降至18 nt以下时，Cas9介导的基因编辑功能被显著消除，这表明转录调控对引导序列长度变化的耐受性高于基因编辑能力。激活效率受gRNA结合位置的影响；靠近转录起始位点(TSS)的gRNA具有更强的激活效果。此外，靶向有义链的gRNA通常比靶向反义链的更有效。通过设计针对同一启动子的多个sgRNA，可以极大地提高稳定性和激活水平。

2.3 转录激活剂

最流行的转录激活结构域是源自单纯疱疹病毒的VP64，它由四个VP16单元（氨基酸序列：DALDDFDLDML）通过柔性连接肽(GS)连接而成。与VP16相比，多拷贝VP64通过多价相互作用增强了与转录因子结合的稳定性，显著提高了转录激活效率。P65是哺乳动物转录激活结构域，VP64和P65常用作真核细胞基因表达的效应物，Rta源自EB病毒R反式激活因子，通过将VP64与p65和Rta串联融合，构建了三重人工转录激活结构域VPR，显示出比单独使用VP64更强的基因激活能力。因此，在CRISPRa系统中，可采用多个转录激活剂的串联结构以增强目标基因的高效表达。然而，对于跨物种的基因表达，不同的dCas蛋白和激活结构域组合需要分别优化。

3 基因激活编辑技术的进展

从基础转录激活(VP64, p65)到增强型转录激活(SunTag系统, dCas9-VPR系统)再到协同激活介体系统(SAM系统)，迄今为止，作物中使用的CRISPR转录激活策略经历了多次进步。

3.1 第一代CRISPR激活系统

3.1.1 dCas9-VP64

真核细胞中的第一代CRISPR激活方法通常涉及将催化失活的dCas9蛋白直接与p65和VP64等转录激活结构域融合。该方法具有上调当前表达基因以及激活报告基因或沉默的内源基因的能力。然而，当使用单一向导RNA(gRNA)进行靶向时，dCas9-VP64在细菌和哺乳动物细胞中显示出非常低的激活效果，平均激活倍数约为2-6倍。该方法在植物系统中也显示出相当大的激活潜力。例如，它可以激活葡萄中的尿苷二磷酸葡萄糖黄酮类糖苷转移酶(UFGT)基因，效率为1.6-5.6倍。通过使用多个gRNA进行靶向可以提高激活效果。例如，在拟南芥中，它有效地将AtPAP1和miR319基因的表达提高了2-7倍，而在本氏烟草中，它将受NOS启动子调控的荧光素酶报告基因的表达提高了1-2.5倍。为了进一步提高功效，研究人员开发了dCas9-VP64的类似物，如dCas9-EDLL和dCas9-TAD（转录激活结构域）。瞬时表达实验表明，这两种类似物均显著激活了Bs3::uidA报告基因的表达（高达14倍），适当增加gRNA的数量进一步提高了激活水平。

3.1.2 dCas9-TV

dCas9-TV系统是一种增强且更有效的变体。dCas9-6TAL-VP128复合物由两个VP64二聚体与六个转录激活样效应因子(TAL)结构域进一步偶联而成。与基础系统相比，该系统在跨物种中表现出显著增强的激活能力：它在拟南芥中激活WRKY30基因达139倍，而dCas9-VP64几乎无效；它在水稻中激活GW7和ER1基因分别达79和62倍；在HEK293T细胞中激活ASCL1和OCT4基因分别达46和14.6倍。与dCas9-VP64相比，dCas9-TV系统在激活葡萄UFGT和冷响应转录因子基因CBF4方面也表现出更高的效率。值得注意的是，当dCas9-TV同时靶向水稻OsGW7和OsER1基因时，单个sgRNA实现了高达3738倍的表达上调，且该激活效应稳定遗传至T3代。基于此，优化的dCas9-TV系统已被应用于作物改良。例如，通过聚焦于棉花中三个重要基因（赤霉素合成的GhKAO2、纤维伸长的GhEXO2和盐胁迫响应转录因子的GhSOS3）的激活，有效产生了高产、长纤维和耐逆的新种质。这种转录激活方法在抗病领域同样成功，增加了豇豆中几个防御相关基因的表达（Pv-lectin增加6.97倍，Pv-thionin增加5.7倍，PvD1增加1.37倍）。

3.2 第二代CRISPR激活系统

3.2.1 dCas9-VPR

为了实现更有效的激活，研究人员尝试将多个转录激活剂组装到单个dCas9-gRNA复合物上。VP64、p65AD和Rta47是三个转录激活剂，将其激活结构域融合成串联组织的三效分子(VPR)，再与dCas9整合形成dCas9-VPR系统。该技术已成功用于多种细胞类型，结果表明它能有效促进基因表达。与采用单一转录因子的dCas9-VP64融合蛋白相比，它可将内源基因mRNA水平提高约22-320倍。

3.2.2 CRISPRa-SunTag

由几个串联重复的短肽GCN4（通常4-20个拷贝）组成的第二代扩增系统SunTag。每个GCN4单元可以选择性地结合单链抗体scFv，从而产生高效的信号级联放大。Tanenbaum等人最初创建该技术是为了提高CRISPRa系统的转录激活效率。将SunTag连接到dCas9蛋白的N端或C端，极大地增强了其参与转录激活结构域(TADs)的能力。与传统的CRISPRa-VPR系统相比，SunTag技术显著提高了基因激活效率。SunTag不仅能够同时招募多个转录因子和调节元件，还能实现多个转录调节因子的协同作用，从而同步激活多个基因。目前，SunTag信号放大系统与CRISPRa技术的整合已广泛应用于包括哺乳动物、植物和酿酒酵母在内的多种生物系统。此外，研究团队还专注于将CRISPR激活系统与其他信号放大策略相结合。SunTag不仅适用于基因激活、活细胞成像和DNA甲基化编辑，还可以与VP64共整合到碱基编辑器中，有效提高碱基编辑效率。在RNA水平上，dCas13a可连接结合SunTag的单链抗体scFv，从而锚定靶RNA。多个scFv-GCN4复合物可被单个dCas13a分子招募，导致主信号放大。基于这一概念构建的dCas13a-SunTag-BiFC系统已有效地对内源性RNA进行了定位和成像。dCas9-SunTag-VP64系统利用SunTag的多价招募能力聚集大量VP64转录激活单元，有效且选择性地激活人类潜伏的HIV-1原病毒。此外，研究人员通过将SunTag中的sgRNA表达模块与β-雌二醇诱导型XVE系统相结合，创建了一种名为ER-Tag的新型诱导型CRISPR激活工具。该工具已在拟南芥、苜蓿、草莓和羊草等植物中成功实现多基因协调调控。基于灵活的SunTag架构，dCas12a也可与10×GCN4肽融合，并利用远红光诱导scFv-p65-HSF1激活剂表达，随后招募至dCas12a-GCN4复合物。由此产生的远红光诱导CRISPR-dCas12a系统FIdCA在小鼠模型中实现了超过100倍的基因激活效率。Steven等人使用基于dCas9-10×GCN4和scFv-sfGFP-VP64构建的SunTag VP64转录激活系统，成功激活了拟南芥FWA基因，通过降低其启动子区域的CG甲基化水平导致晚花表型。此外，利用Cas9-SunTag-VP64和dCas9-SunTag-p300系统激活了人类基因组的长末端重复序列LTR12C，调控了邻近蛋白质编码基因的表达。分子设计中改进型的scFv对SunTag支架中的GCN4表位表现出强亲和力和特异性。当细胞内产生scFv-效应蛋白融合物时，由于多个scFv可以同时结合单个SunTag支架上的多个GCN4位点，大量效应蛋白可被招募至靶基因组位点。在激活ASCL1和OCT4等内源基因以及人类报告基因方面，该方法远比传统的dCas9-VP64直接融合系统有效。

MoonTag

为了解决SunTag系统中scFv在植物中表达不稳定的问题，Casas-Mollano等人创建了MoonTag纳米抗体-肽相互作用系统。在该系统中，NbGP41纳米抗体与VP64融合，dCas9与源自HIV gp41的多个重复GP41肽偶联。MoonTag在植物中表现出优于SunTag的激活效率和稳定表达及广谱活性。

CRISPRa-SAM

（协同激活介体）：CRISPRa-SAM系统是基于CRISPR-dCas9的高效转录激活工具。整个系统由三部分组成：(1) dCas9与VP64转录激活结构域的融合蛋白；(2) 修饰的sgRNA（也称为Scaffold RNA），其支架上具有两个RNA发夹结构，用于结合MS2噬菌体衣壳蛋白（通常位于tracrRNA的栓系环区和/或茎环2区）；(3) 激活辅激活剂融合蛋白MCP-p65-HSF1(MPH)，其特异性识别sgRNA上的MS2发夹并将p65和HSF1招募至靶位点。当这三者共表达时，MCP-p65-HSF1融合蛋白被MS2发夹招募，dCas9-VP64在设计好的sgRNA引导下通过互补序列附着到特定的基因组位置。这种组装在靶启动子区域形成了包含多个激活结构域的复合物，实现协同且高效的转录激活。该系统在基因功能研究和疾病治疗中已显示出广泛的应用。例如，在成熟脂肪细胞中，CRISPRa-SAM介导的干预显著增加了重要的脂肪生成基因，如Pparγ2（高达104倍）和Ucp1（高达4×103倍）。此外，dCas9-SAM系统已被开发为一种逆转HIV潜伏期的新型工具，为永久清除HIV-1潜伏库提供了可能，并在癌症治疗等领域具有重要前景。需要进一步研究以充分了解dCas9-SAM系统在作物中的潜在应用。

CRISPR-Act2.0

Lowder等人开发了一种基于dCas9-VP64的系统，结合了gRNA 2.0支架并招募MS2-VP64融合蛋白。通过T2A肽链，该系统支持dCas9-VP64和MS2-VP64的共表达，支持多gRNA组装以同时靶向多个基因启动子。在拟南芥中，CRISPR-Act2.0显著提高了激活效率，使FIS2表达增加高达1500倍，PAP1表达增加30-45倍。它也显示了在单子叶植物中的适用性。

3.3 第三代CRISPR激活系统

3.3.1 CRISPR-Act3.0

关键元件包括：与VP64激活结构域融合的dCas9；具有两个MS2 RNA适配器以招募MCP蛋白的gR2.0 sgRNA支架；与MCP融合以增强激活剂招募能力的10xGCN4SunTag；以及显著提高激活效率的新型转录激活结构域2xTAD。CRISPR-Act3.0在水稻原生质体中针对多个基因实现了比第二代系统高4-6倍的激活效率，其中OsGW7和OsER1的激活分别超过250倍和100倍，支持同时激活合成途径中的多达七个基因。值得注意的是，当应用CRISPR-Act3.0方法时，dCas12b系统可以识别VTTV PAM序列，使其适用于富含AT的启动子。开发的dSpRY-Act3.0系统可靶向多种PAM类型，显示出几乎可忽略的PAM限制。使用针对几种内源基因设计的sgRNA进行瞬时表达和稳定转化研究，将CRISPR/Cas3.0系统用于铁皮石斛。MCT的瞬时激活显著增加了石斛碱含量。在利用靶向MCT、STR1、CYP94C1和HMGR等基因的sgRNA进行稳定转化后，石斛碱含量增加了高达35.6%，表明CRISPR/Act3.0在低含量物种中表现出更显著的效果。

3.3.2 CRISPR-Combo

最初在水稻中创建的CRISPR-Combo系统，吸引转录激活复合物MCP-SunTag-2xTAD的MS2发夹结构。它允许同时进行基因激活和基因组编辑，正如在番茄中SISFT的显著激活所证明的那样。总结上述激活系统表明，SunTag、dCas9-VPR和dCas9-TV主要通过修饰dCas9蛋白实现转录激活。相比之下，SAM、CRISPR-Act2.0和CRISPR-Act3.0系统主要通过工程化gRNA设计来增强激活能力。需要更深入的分析和新的实验数据来确定这些方法是否能在植物系统中有效增加靶基因表达。

4 基因激活编辑技术在作物中的应用

随着各种CRISPR-dCas基因激活系统的发展，它们作为工具在不同研究领域的应用日益广泛。这些激活技术的主要应用集中在代谢、抗逆育种、开花调控和植物再生等方面。目前水稻是使用CRISPRa技术研究最广泛的作物，其应用主要集中在调控产量和耐逆性等关键农艺性状上。例如，通过CRISPRa激活内源基因OsGW7导致籽粒形状更长，从而提高了外观品质和产量。在耐逆性方面，激活控制气孔发育的OsER1基因提高了水稻的抗旱性。值得注意的是，与传统方法相比，CRISPRa在增强抗逆性方面展示了独特的优势。例如，使用CRISPRa-VPR系统激活拟南芥AtAREB1基因，显著改善了耐旱性，且没有传统过表达带来的生长迟缓等负面影响。这为平衡抗逆性与生长发育提供了新策略。此外，CRISPRa在解决作物遗传转化挑战方面显示出巨大潜力。许多优良作物品种面临组织培养再生困难的问题，严重限制了基因编辑技术的应用。为了突破这一瓶颈，研究人员采用CRISPRa技术精确激活内源再生相关基因（如WUS），即使在番茄等传统上难以再生的物种中也显著提高了愈伤组织再生效率。这一创新策略已成功应用于拟南芥、杨树、辣椒、大豆和甘蔗等多种再生能力较低的植物，显著扩展了基因编辑技术在作物改良中的应用范围。利用SunTag、CRISPR-Combo和CRISPR-Act3.0系统测试了FWA和AtFT基因以调控开花时间。结果显示出高激活效率，分别表现出不同的晚花和早花表型。这为缩短育种周期提供了有力支持。CRISPR-Combo（杨树、水稻）和ER-Tag（苜蓿、羊草）在植物再生和遗传转化中均表现出100至4000倍的基因激活效率，大大提高了再生率。dCas9-SET-MS2-SET和dCas12-SET系统证明了番茄强烈的体细胞胚胎诱导和生根效率，效率提高了3到6倍。这些方法为提高抗性物种的转化成功率和再生效率提供了前瞻性手段。在应激反应调控方面，dCas9-SET、dCas9-VP64和CRISPR/dCas12a-SET(LbCpf1)系统均显著提高了番茄SIPR-1（40-110倍）和SIPAL2（6.5倍）的表达水平，在不改变农艺性状特征的情况下改善了抗病性。dCas9-TV系统通过增加Pv-lectin、PvD1和Pv-thionin的表达增强豇豆抗菌肽合成能力，并通过提高CBF4表达增强葡萄的耐寒性。这些研究表明，仅仅加倍或三倍某些基因的表达水平就能诱导显著的表型变化。这表明生物系统可能对特定基因的表达水平表现出高度敏感性。CRISPR激活技术被用于精确增加植物代谢途径。在铁皮石斛中，CRISPR-Act3.0系统同时激活了参与石斛碱生物合成的多个内源基因（如MCT、CMAO和BGLU），成功使石斛碱产量增加了30.1%（瞬时转化）和35.6%（稳定转基因株系）。在拟南芥中，内皮层特异性CRISPRa-SunTag系统通过同时激活六个类黄酮合酶基因，精确重构了代谢途径，成功将突变体植株中的类黄酮积累恢复到野生型水平。通过pPVX_VIGR感染递送的dCasEV2.1系统在烟草中显著增加了非挥发性代谢物的积累。这些调查表明，CRISPRa技术为研究合成生物学中复杂的植物天然产物提供了有效的工具。

5 将CRISPRa导入植物的各种方法

CRISPRa组件必须成功递送到植物细胞核中才能有效发挥作用。递送代表了CRISPRa应用的主要瓶颈。目前，将CRISPRa导入植物主要涉及以下五种方法：

5.1 农杆菌介导的转化

农杆菌介导的遗传转化代表了植物基因工程中最成熟的技术。它允许递送大DNA片段并提供稳定的转化效率。结合添加再生促进因子CaREF1、RUBY视觉报告系统和优化基因型筛选等技术，可以显著提高辣椒等难转化作物的转化效率。

5.2 基因枪轰击

基因枪是单子叶植物（如小麦和玉米）和部分难以使用农杆菌转化的木本植物的推荐转化技术，它可以递送大DNA片段。编码全套组件的质粒DNA可以被递送到CRISPRa。虽然基于DNA稳定遗传转化的基因枪方法和农杆菌介导的转化仍然被广泛使用，但它们在整合外源DNA方面受到监管限制。

5.3 核糖核蛋白(RNP)的递送

核糖核蛋白递送是指将在体外纯化的Cas融合蛋白与体外转录的gRNA预组装成复合物，然后直接导入植物细胞。编辑元件在完成其功能后会被内源性蛋白酶和RNase迅速降解，防止整合到基因组中。最终产品不含外源DNA，但其递送效率依赖于PEG介导的原生质体转染、基因枪轰击、新兴纳米载体技术和细胞穿透肽技术。

5.4 病毒载体介导的递送

病毒递送消除了组织培养的需要，实现系统递送，且具有操作周期短的特点。对于CRISPRa，病毒介导的瞬时激活特别适合代谢工程。然而，RNA病毒载体容量有限，难以容纳较大的dCas9-激活剂融合蛋白序列；病毒感染可能干扰植物内源基因表达；生物安全监管要求可能会限制病毒载体的田间应用。总之，在研究中有必要根据目标物种的生物学特性、实验目标和监管要求来做出适当的技术选择。

6 挑战与展望

尽管为植物育种提供了强大的工具，CRISPRa技术在广泛应用之前仍然存在许多生物学和技术障碍。这些限制主要集中在激活效率、靶标选择和递送系统上：

• •
  激活效率不均：在目前CRISPRa应用中，主要障碍是激活效率的不均匀。不同基因对CRISPRa系统的反应存在显著差异，即使使用像VPR或SunTag这样非常有效的激活结构，某些基因的表达可能仅增加2-3倍或根本不激活，而另一些则可能经历高达千倍的上调。总体而言，CRISPRa对低到中等基线表达水平的基因表现出优越的激活功效，然而，它经常无法克服高度甲基化或深度沉默基因中的染色质水平抑制。此外，植物启动子的复杂性和多样性进一步使精确激活复杂化，sgRNA靶向的理想区域通常位于转录起始位点上游-50至-500 bp之间，但是，如果该区域位于致密包装的染色质区域内或缺乏适当的PAM序列（如NGG），激活效果会显著下降。
• •
  脱靶转录和非特异性激活风险：与传统的CRISPR切割系统的脱靶效应不同，植物基因组中的增强子和启动子元件通常表现出区域调节特性，同时影响多个相邻基因的表达。结合到靶位点后，CRISPRa复合物可能会招募转录机制（如RNA聚合酶），无意中激活靶标周围的其他基因，导致意外的表型变化。即使使用高保真dCas9变体，仍有可能与其他基因组位置结合。虽然在错误的位点没有发生DNA切割，但在错误位点招募转录激活剂可能会轻微破坏全基因组转录网络，引发全局表达扰动。
• •
  载体尺寸限制和递送效率问题：CRISPRa系统在物理尺寸上明显大于传统CRISPR系统。传统的Cas9基因约为4 kb，而dCas9蛋白本身的分子量约为160 kDa，与转录激活结构域融合后尺寸进一步增加。这种尺寸的增加不仅使载体构建复杂化，还降低了其进入植物细胞的效率。此外，许多适用于植物的病毒载体（常用于瞬时表达）施加了严格的装载容量限制。过大的CRISPRa组件难以包装进单个病毒颗粒中，从而限制了高效病毒递送系统的应用。同时，采用农杆菌介导的转化或基因枪技术时，质粒尺寸的增加通常会降低基因组整合效率。
• •
  多基因协同激活具有挑战性。多基因堆叠中重复启动子的使用可能导致基因沉默，协调的多基因激活需要明确的途径和合成路线。此外，随着被激活基因数量的增加，单个基因的激活效率可能会下降，强行持续激活特定的内源基因可能会破坏植物体内的代谢平衡。例如，虽然持续激活免疫基