《Journal of Animal Science and Biotechnology》：CRISPR-enhanced microalgae biosynthesis: a promising approach for future functional feed ingredients
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微藻是能够合成多种高附加值生物活性化合物的光合微生物，包括优质蛋白质、多不饱和脂肪酸（PUFAs）、色素和维生素。这些天然产物在促进畜禽生长与健康方面表现出显著潜力，其生物活性和营养效益优于化学合成替代品。然而，微藻源天然产物的商业化生产仍不足以满足日益增长的
微藻是能够合成多种高附加值生物活性化合物的光合微生物，包括优质蛋白质、多不饱和脂肪酸（PUFAs）、色素和维生素。这些天然产物在促进畜禽生长与健康方面表现出显著潜力，其生物活性和营养效益优于化学合成替代品。然而，微藻源天然产物的商业化生产仍不足以满足日益增长的市场需求。利用合成生物学策略，特别是CRISPR系统，提高微藻细胞工厂的生产力，对于扩大高价值产物的生物合成规模至关重要。本文综述了微藻细胞工厂的当前应用、构建策略及关键通路节点，重点阐述了基于CRISPR的基因组编辑技术在优化微藻营养谱方面的突破，以及微藻在畜禽生产中应用的最新进展，并对未来发展提供了前瞻性视角。
基于微藻细胞工厂的生物合成
微藻细胞工厂是一种独特的光合细胞工厂，能够利用自养生长模式，将每个细胞转化为独立的生物合成平台。与传统的化学工业催化过程相比，利用酶或微生物系统的生物方法具有反应条件温和、底物特异性高和能耗低的优势。微藻细胞固有的生化反应和转运过程，以及细胞器作为专门的“生产单元”，使其能够作为高效的反应器用于可持续的生物制造。通过系统研究底盘微藻的生物合成元件、代谢途径、调控机制及胁迫响应，研究人员利用合成生物学工具设计和构建了新型高性能细胞工厂。
微藻细胞工厂的应用极具多样性，主要包括高值生物活性化合物合成、环境生物修复和可持续生物燃料生产。与传统的大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等细胞工厂相比，微藻生长速率较慢且产物浓度较低，因此需要开发适合其特性的特定高值产品。目前已获准作为饲料原料的微藻包括蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）和钝顶螺旋藻（Spirulina platensis），而杜氏盐藻（Dunaliella salina）产生的β-胡萝卜素和雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）产生的虾青素则被广泛用作食品和饲料的营养添加剂。此外，裂殖壶菌（Schizochytriumsp.）、拟微绿球藻（Nannochloropsis gaditana）和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）等物种也已获批。除了营养添加剂，微藻在环境修复中也发挥着重要作用，它们能利用废水中的氮磷并固定CO2，将废水和烟气转化为有价值的生物质，耦合太阳能技术可降低碳足迹。在生物燃料领域，尽管某些微藻菌株具有较高的固有脂质含量，但其低生产率和对长期氮缺乏或其他胁迫条件的需求导致生产成本高昂，因此构建具有快速生长、强环境适应性和高目标产物积累能力的工程菌株是实现工业化的关键。
微藻细胞工厂的构建策略
开发高性能菌株对于微藻生物技术的应用至关重要。常见的底盘微藻包括聚球藻（Synechococcussp.）、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa），这些藻种基因组较小且遗传转化方法成熟。构建策略主要分为非理性构建和理性构建两类。
非理性构建包括适应性实验室进化（ALE）、诱变育种和基因组重排。ALE是一种在不依赖宿主遗传背景详细知识的情况下，通过连续传代定向进化微生物表型的方法，可用于提高微藻对烟气或酚类的耐受性，或调节脂质合成。诱变育种则利用物理（如紫外线UV、常压室温等离子体ARTP）或化学诱变剂（如甲基磺酸乙酯EMS）诱导基因突变，具有操作简便的特点。例如，ARTP诱变结合暗培养可有效提高突变效率，已成功用于选育叶绿素缺陷型且叶黄素含量提高的突变株。基因组重排则是通过原生质体融合技术将多个亲本菌株的遗传性状整合到单个菌株中，通常结合多轮诱变以积累有益突变，从而提高虾青素等产物的产量。
理性构建则依赖于基因工程和基因组编辑技术。随着微藻基因组测序的完成，研究人员能够通过核转化、叶绿体转化和RNA干扰（RNAi）等手段实现外源DNA的表达。例如，通过电穿孔介导的质粒转移在三角褐指藻中过表达脂联蛋白可显著提高岩藻黄质产量。然而，传统遗传工程效率较低，而以CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑技术因其高效率、高特异性和低成本，已成为改造微藻代谢网络的有力工具。
合成途径中的关键节点
构建高效的微藻细胞工厂取决于目标基因水平和关键酶活性，同时需要避免代谢产物过度积累对细胞代谢网络的破坏。因此，对关键生物合成节点进行动态调控是提升高值化合物产量的有效策略。
在靶基因表达调控方面，启动子选择、内含子介导和密码子优化是关键。强启动子（如源自集胞藻6803的Pcpc560和莱茵衣藻的合成AR1启动子）能有效驱动外源蛋白表达。内含子的插入可通过改善转录、核输出、mRNA稳定性和翻译效率来增强基因表达，但其插入位置会影响表达水平。此外，基于宿主偏好性的密码子优化也能显著提升转基因表达。为了克服转基因沉默，终止子元件、高GC含量以及基质附着区（MARs）的应用被证明是有效的策略，其中MARs能通过减少拷贝数诱导的同源性抑制来提高表达稳定性。
在酶催化活性调控方面，除转录控制外，酶活性的翻译后修饰至关重要。例如，Orange蛋白作为八氢番茄红素合酶（PSY）的关键调节因子，其过表达可稳定酶复合物并促进类胡萝卜素生物合成。在四吡咯生物合成中，谷氨酸-tRNA还原酶（GluTR）结合蛋白（GBP）和FLU调节蛋白通过反馈抑制或失活GluTR来协调5-氨基乙酰丙酸的合成。此外，铁氧还蛋白和NADPH依赖性硫氧还蛋白还原酶C（NTRC）途径的协同作用维持了叶绿素生物合成的适当通量。为了解决酶过表达可能引起的反馈抑制，表达抗反馈抑制的酶变体或破坏转录及变构调节是有效的解决途径，例如人工设计的PSY变体在斜生栅藻中的应用显著提高了类胡萝卜素产量。
在代谢网络层面，由于翻译效率低、中间体毒性、酶抑制和底物竞争等问题，单纯的代谢途径修饰往往难以达到预期产量。精确平衡代谢通量是构建工业可行细胞工厂的核心。诱导型启动子和核糖开关（Riboswitches）为实现这一目标提供了工具，前者可根据生化信号动态调节基因表达，后者则通过配体结合在翻译水平上调节基因。例如，在莱茵衣藻中已鉴定出硫胺素焦磷酸（TPP）核糖开关，并被改造用于控制萜类生物合成。此外，基于转录因子（TFs）和群体感应（Quorum Sensing）的合成基因回路也被开发出来，用于动态调节多个代谢通量，实现代谢前体与终产物之间的线性关系感知与调整。
CRISPR系统在优化微藻生物质饲料特性中的应用
CRISPR系统是目前最通用、最高效的基因组编辑平台，能够实现基因敲除/敲入、靶向诱变、染色体重排和转录调控。在微藻代谢工程中，CRISPR/Cas9、CRISPR-Cas12a、CRISPR激活/干扰（CRISPRa/i）和Cas-核糖核蛋白（RNP）是主要应用的系统。
CRISPR/Cas9是最广泛采用的系统，它利用单引导RNA（sgRNA）引导Cas9核酸酶产生靶向DNA双链断裂，主要通过非同源末端连接（NHEJ）或同源依赖性重组（HDR）进行修复。在微藻中，NHEJ介导的CRISPR/Cas9主要用于生物活性物质的积累，例如敲除β-胡萝卜素羟化酶（CHYB）可增加杜氏盐藻中的β-胡萝卜素产量，或敲除羧基转移酶相互作用蛋白1（CTI1）基因可使莱茵衣藻的油脂产量增加25%。此外，利用CRISPR/Cas9降低细胞壁厚度和纤维素含量，可提高微藻的脂质可提取性。
与CRISPR/Cas9相比，CRISPR-Cas12a具有不依赖tracrRNA、编辑精度更高和细胞毒性显著降低的优势，并已成功应用于微藻的基因编辑。为了解决Cas蛋白和sgRNA基因的基因组整合降低转基因微藻存活率的问题，研究人员开发了RNP递送系统。该系统通过将体外转录并预组装的Cas蛋白与sgRNA形成的复合物通过电穿孔或生物弹轰击导入藻细胞，具有瞬时活性高、脱靶效应小的优点，已成功用于提高莱茵衣藻、裸藻（Euglena gracilis）和紫球藻（Porphyridiumsp.）的色素产量。
CRISPRa/i系统则由催化失活的Cas9（dCas9）和gRNA组成，可在不产生遗传改变的情况下调节转录。该系统已被广泛用于微藻代谢网络的优化，例如在索罗金小球藻（Chlorella sorokiniana）中，利用CRISPRa/i介导的工程改造显著提高了蛋白质和脂质的产量，其中CRISPRi-KRAB抑制使蛋白质含量提升至65%，同时刺激了脂质合成。
尽管传统CRISPR-Cas系统面临严格的PAM（Protospacer Adjacent Motif）要求和脱靶效应等限制，但通过蛋白质工程改造Cas9（如SpG和SpRY变体）已放宽了PAM特异性，使得靶向修饰更多样的代谢途径成为可能。这些先进的CRISPR平台极大地拓宽了微藻生物活性物质的生产范围，提高了产量和产品特异性，从而优化了微藻的饲料特性。
微藻在畜牧生产中的应用进展
随着畜牧业规模的不断扩大，寻求可持续的非粮生物质解决方案成为行业发展的关键。微藻凭借其高营养密度、生物安全性和产量可靠性，成为理想的功能性饲料成分。
微藻可作为可持续的蛋白质来源部分替代传统饲料中的谷物和豆类。微藻富含蛋白质、维生素、矿物质以及蛋氨酸和赖氨酸等必需氨基酸，能够改善肉类及其产品质量，减少对昂贵合成营养添加剂的依赖。研究表明，用小球藻（Chlorella vulgaris）部分替代豆粕可降低断奶仔猪的腹泻率，且不影响其生长性能。此外，微藻中的多不饱和脂肪酸（如DHA和EPA）和色素（如虾青素和叶黄素）在畜禽和水产养殖中作为免疫增强剂和着色剂具有重要应用价值。尽管目前已有螺旋藻、小球藻和雨生红球藻等商业化应用，但针对大多数工业相关微藻物种的特定CRISPR编辑工具的缺乏仍是主要瓶颈。开发优化的CRISPR系统以实现微藻生物活性物质的规模化高效合成，对于推动微藻在动物营养中的大规模应用至关重要。
