基于晶体学和电子顺磁共振（EPR）技术对Cu2+与血清白蛋白结合的表征：ATCUN配位位点及其他结合位点

《Inorganic Chemistry Frontiers》：Crystallographic and EPR-based characterisation of Cu2+-binding to serum albumin: ATCUN coordination and additional sites

　　铜的稳态对哺乳动物的生理功能至关重要。血清白蛋白在血浆中的铜转运和缓冲中起着重要作用，但其Cu2+结合位点的特性尚未完全阐明。在这里，我们报告了首个哺乳动物血清白蛋白（本例中为马血清白蛋白）与铜（II）结合的X射线晶体结构。该结构显示出一个高亲和力的ATCUN位点，具有典型的平面四方形几何结构。此外，在五个二级结合位点中也观察到了Cu2+的结合，包括A位点和B位点以及其他含有组氨酸的位点（涉及His287、His317和His509）。连续波电子顺磁共振（EPR）光谱进一步支持了ATCUN位点的平面四方形配位，通过在结合不到一摩尔当量的Cu2+时出现的低g光谱特征。电子顺磁共振分离实验（ESEEM）和HYSCORE实验检测到了核四极相互作用和弱耦合的14N信号，这表明组氨酸的参与以及在较高Cu2+负载时水分子的配位增加。基于Ridme算法的距离分布和结构模拟表明多个位点同时被占据，其中ATCUN位点和B位点有很强的证据，而在较高Cu2+当量时远端组氨酸（His287、His317）也有部分参与。这些发现支持了一种动态的多位点结合模型，其中短程距离来源于ATCUN位点和B位点的共占据，而长程峰则反映了远端组氨酸位点的贡献。

1. 引言

血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，在转运各种内源性和外源性物质（包括金属离子）方面起着关键作用。尽管 ceruloplasmin 是血浆中主要的Cu2+结合蛋白，但Cu2+与白蛋白之间的相互作用非常重要，有助于调节游离Cu2+的水平，防止由于铜的氧化还原活性引起的氧化损伤，并通过人类铜转运蛋白1（hcTr1）促进细胞对铜的吸收。白蛋白主要在氨基端的铜/镍位点（ATCUN基序）以高亲和力和特异性（K = 10^16）结合Cu2+。Ni2+也结合在这个位点，但亲和力明显较低（K = 3.98 × 10^9）。ATCUN位点首次被证实具有Cu2+结合能力是在1960年，当时发现氯化铜（II）能够阻止白蛋白的氨基与Sanger试剂氟二硝基苯反应。随后的肽研究表明，Cu2+与牛血清白蛋白（BSA）的残基1–24以及四肽Asp–Thr–His–Lys（残基1–4）强烈结合，其亲和力与完整的BSA相当。后来的1H NMR分析确认了Cu2+/Ni2+位点的存在，并提示了平面四方形配位几何结构。白蛋白上还存在其他次级Cu2+结合位点，这些位点可能在Cu2+过载时参与Cu2+的结合和清除。最近，脉冲电子顺磁共振（EPR）光谱实验表明，人类血清白蛋白（HSA）上的次级Cu2+结合位点涉及His9和His288残基。在过去的十年左右时间里，已经对白蛋白上的几个金属离子结合位点进行了结构表征，包括Zn2+、Co2+和Ca2+的结合位点。除了自由金属离子外，还有多项研究报道了与含金属化合物形成的复合物，尤其是与硫代半卡巴嗪衍生物形成的复合物（包括Cu（II）的复合物）。然而，到目前为止，尚未阐明游离Cu2+离子与其生理金属结合位点结合的结构。包含金属离子和含金属化合物的白蛋白结构总结可以在表S1中找到。在这项研究中，我们报告了马血清白蛋白（ESA）与Cu2+复合物的X射线晶体结构，提供了对其铜结合位点位置和配位环境的详细见解。选择ESA进行这些实验是因为它比HSA更容易结晶，并且在缺乏稳定脂肪酸的情况下能获得更高分辨率的衍射数据（图S1）。此外，ESA和HSA中的Cu2+结合残基具有高度保守性，这支持了ESA作为结构模型的适用性。为了补充这些结构发现，我们使用了脉冲EPR光谱技术，以便更详细地研究ESA内各个Cu2+结合位点的贡献。

2. 实验

2.1. 材料

用于X射线晶体学的ESA是从自然来源分离得到的，从Equitech-Bio（美国德克萨斯州Kerrville；#ESA62）购买的冻干粉末，并按照以下方法进一步纯化。对于EPR实验，ESA是从马血浆中提取的。最终蛋白质纯度通过SDS-PAGE和凝胶过滤层析法评估，超过95%。

2.2. ESA纯化和结晶

ESA溶解在纯化缓冲液（10 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 7.5）中，并使用与流动相相同的缓冲液通过Superdex 200柱进行尺寸排阻层析纯化。所有纯化步骤均在4 °C下使用?KTA FPLC系统（Cytiva）进行。对应于单体物种（约55–60 kDa）的馏分被收集并用Amicon Ultra离心过滤器（30 kDa MWCO）浓缩。蛋白质浓度通过 Shimadzu UV-2450分光光度计（日本京都）在280 nm处测量吸光度来确定。然后调整浓度至约50 mg mL^-1。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了纯化蛋白质的均匀性和完整性。使用滴定-蒸汽扩散法在96孔板上获得了与Cu2+结合的ESA晶体。板子的设置使用Mosquito结晶机器人（TTP Labtech，马萨诸塞州剑桥）完成，方法是将200 nL的ESA蛋白溶液（36 mg mL^-1）与200 nL的储液溶液以1:1的比例混合。储液溶液含有0.2 M Li2SO4、0.1 M Tris-HCl（pH 7.4）、2.2 M (NH4)2SO4和5 mM CuCl2，从而在结晶滴中产生约2.5 mM的最终Cu2+浓度。结晶板在室温下孵育，并使用Paratone-N油作为冷冻保护剂。

2.3. 数据收集和结构确定

X射线衍射数据是在阿贡国家实验室（Argonne, IL）的SBC-CAT 19-BM光束线上，于100 K温度下从Cu2+–ESA复合物的单晶中收集的。数据收集在硒吸收K边（12 670 eV），此时仍可检测到Cu2+离子的异常衍射。衍射图像使用HKL-3000软件处理并按比例异常模式缩放，以便计算Cu2+的异常差异图。结构是通过使用ESA结构（Protein Data Bank (PDB) ID: 7mbl）作为搜索模型进行分子替代来解决的。初始电子密度图和初步模型在HKL-3000中生成，该软件整合了MOLREP和其他CCP4套件中的程序。模型构建和精修的迭代循环在COOT和REFMAC中通过HKL-3000接口进行。最终模型质量使用MolProbity独立工具以及在HKL-3000内部进行评估，同时使用wwPDB验证工具进行评估。衍射数据收集、结构精修和结构质量的统计信息总结在表1中。

2.4. EPR样品制备

制备约1 mM的ESA储备溶液，方法是重新悬浮冻干蛋白在质子化或氘代缓冲液中（50 mM Tris (Merck)，50 mM NaCl (Fisher Scientific)，pH 7.4。CuCl2（Thermo Scientific Chemicals）的储备溶液在D2O（Merck）中制备，浓度为10 mM，用于氘代样品；在H2O中制备用于质子化样品。样品的最终体积为65 μL，最终蛋白质浓度为250 μM，含有50%的冷冻保护剂（质子化甘油（Alfa Aesar）或氘代甘油（Cortecnet）。对于质子化样品，添加了不同浓度的CuCl2（0至5摩尔当量），而氘代样品含有2摩尔当量的CuCl2。所有样品都立即在液氮中快速冷冻。

2.5. 连续波（CW）EPR

质子化样品的CW EPR光谱是在120 K温度下使用Bruker EMX plus光谱仪获得的，该光谱仪配备有ELEXSYS Super Hi-Q共振器，工作频率约为9.5 GHz，调制频率为100 kHz。温度由ER4141 VT氮气可变温度单元（Bruker）控制。伪滴定样品（0至5摩尔当量的Cu2+）的CW光谱在3100 G中心记录，场扫描范围为1600 G，时间常数为20.48 ms，转换时间为20.62 ms，分辨率为2667点。所有光谱都进行了背景和相位校正。使用Xenon软件进行了双积分处理。CW EPR光谱的模拟和拟合使用Easyspin中的pepper函数完成。

2.6. 脉冲EPR

脉冲EPR实验在X波段（9 GHz）和Q波段（34 GHz）频率下使用Bruker ELEXSYS E580光谱仪进行，该光谱仪配备了X波段的split-ring共振器（4118X-MS3）和Q波段的3 mm圆柱形共振器（ER 5106QT-2w）。脉冲由脉冲行波管放大器（Applied Systems Engineering）放大，输出功率分别为Q波段的150 W和X波段的1 kW。温度由Cryogenic Ltd提供的无液氦可变温度低温恒温器控制，温度范围为1.8–300 K。

2.7. 超精细光谱（质子化样品）

3脉冲电子自旋回波包络调制（ESEEM）光谱是在X波段30 K下记录的，场位置对应于两个样品的场扫描光谱的最大值，分别含有250 μM ESA和0.5和5摩尔当量的Cu2+。脉冲长度为16 ns的π/2脉冲，脉冲间隔τ对应于1H盲点（约220 ns，相当于质子拉莫频率的倒数约3倍，τ1(H) = 73 ns）。延迟时间‘T’设置为280 ns，并以8 ns的步长递增，采用了4步相位循环。记录了四个τ值，其中脉冲间隔τ增加了36 ns（0.5 × τ1(H)）；第三个τ（292 ns）被选用于HYSCORE实验。数据通过将指数背景衰减函数拟合到相位校正后的数据上来分析，并从数据中减去这个背景，然后在快速傅里叶变换（FFT）后除以相同的背景函数，从而保留了关于振幅的信息。然后对所得到的迹线进行汉明窗处理、零填充和FFT处理，得到绝对（或幅度）光谱。HYSCORE光谱是在X波段15 K下记录的，场位置对应于场扫描光谱的最大值，π/2和π脉冲的脉冲长度分别为16 ns和32 ns。τ根据3脉冲ESEEM的结果设置为1H盲点（约290 ns），初始t1和t2设置为56 ns，采用4步相位循环。数据使用HYSCOREAN进行处理和分析，采用汉明窗函数、三阶多项式背景校正和对角线及反对角线光谱对称化处理，通过调整最小轮廓水平百分比来保持每个光谱的噪声量相似。

2.8. 放松诱导的偶极调制增强（RIDME；氘代样品）

在30 K下、Q波段频率（34 GHz）进行松弛时间测量，场位置对应于含有250 μM蛋白质和2摩尔当量Cu2+的样品的场扫描光谱的最大值。横向退相位时间常数Tm（对应于T2和其他退相位机制）是通过记录的2脉冲电子自旋回波衰减实验确定的，起始τ为200 ns，分别使用16 ns和32 ns的脉冲长度作为π/2和π脉冲，并将数据拟合为拉伸指数衰减函数。纵向松弛时间常数T1是通过3脉冲反转恢复测量估计的，记录的τ为800 ns，一个8 ns的反转脉冲和16 ns和32 ns的观察脉冲（分别对应π/2和π脉冲），并将数据拟合为双指数模型。考虑到Cu2+光谱的宽度（约5 GHz），脉冲的狭窄带宽（100–300 MHz）不允许从单个磁场位置均匀采样所有Cu2+取向。因此，在三个不同的磁场位置进行了5脉冲RIDME实验，这些位置分别比Cu2+场扫描光谱的最大值偏移-100、-600和-800 G，以平均取向选择效应，使用的脉冲序列为（π/2 ? τ1 ? π ? (τ1 + t) ? π/2 ? Tmix ? π/2 ? (τ2 ? t) ? π ? τ2 ? 回波），并具有8步相位循环。使用的τ1为400 ns，τ2为2500 ns，射击重复时间（SRT）为400 μs。测量是在混合时间为0.7 × T1（从双指数近似值计算得到的纵向松弛时间）的情况下记录的。数据使用ComparativeDEERAnalyzer 2.0在DeerAnalyze 2022中进行分析，对于每个磁场位置以及总和时间迹线。

2.9. 距离分布的模拟

本文报道的结构中Cu2+原子之间的距离是用PyMOL测量的。然后使用基于Python的DeerLab程序模拟了高斯距离分布，通过选择三个振幅相等且标准差为0.1 nm的原子组合来实现。

3. 结果与讨论

3.1. 使用ESA对Cu2+复合物的结构表征

血清白蛋白上Cu2+结合位点的完整位置和组成之前尚未被表征。在这里，我们获得了一个Cu2+结合的ESA结构（PDB ID：9zmd）。图1展示了标记了金属结合位点的晶体结构概要。所呈现的ESA晶体结构属于P61空间群。该结构在不对称单元中包含一个蛋白质链。该结构采用了特征性的“心形”白蛋白折叠，并保留了在其他白蛋白结构中发现的17个二硫键结构。略微增大的Rfree–Rwork间隙与分辨率相当的白蛋白结构中常见的值一致，反映了白蛋白的固有灵活性（见图S2）。此外，密度足以允许对ATCUN残基进行建模，这在白蛋白结构中并不总是可行的，因为这一区域的固有灵活性。图1

ESA上Cu2+结合位点的位置。Cu2+离子显示为棕色球体。属于第一协调球体的残基显示为棒状并进行了标记，每个残基仅在一个面板上标记。域用罗马数字（I、II、III）标记，子域用字母标记（例如IB），每个子域用不同的颜色表示（如图所示）。为了研究这一点，我们在PDB中识别了320个白蛋白分子，包括那些在不对称单元中包含多个蛋白质副本的结构。对这些结构的分析显示，N端区域具有相当的灵活性，因为只有8%的结构对第一个残基进行了建模，而18%的结构对第二个残基进行了建模（见图S3）。晶体堆积可以强烈影响这一区域，幸运的是，在我们的Cu2+–ESA结构中，协调Cu2+的ATCUN基序被一个位于距离Cu2+场扫描光谱最大值3.4 ?的对称相关蛋白质稳定。这种相互作用可能有助于观察到的第一个残基的明确电子密度（见图S4A）。在我们之前对Co2+-HSA晶体结构（PDB ID：8ew4）的研究中也观察到了类似的效果。在那种情况下，N端与对称相关分子之间的接触，加上Co2+的协调，提高了局部电子密度图的质量（见图S4B）。相比之下，其他白蛋白结构，如PDB ID：1bj5，由于缺乏附近的对称接触，而在N端区域附近包含一个充满溶剂的腔体，因此无法对前两个残基进行建模（见图S4C）。N端区域的固有灵活性使得共结晶对于捕捉Cu2+的结合至关重要，因为ATCUN基序（包括前三个残基）必须采取特定的构象来协调金属。这与参与Zn2+、Co2+结合的更预先组织的位点A和位点B形成对比，在那些结构中可以成功地对预形成的白蛋白晶体进行浸泡处理。例如，在Co2+–HSA晶体结构（PDB ID：8ew4；见图S4B）中，由于与对称相关蛋白质的多次相互作用，N端周围的堆积相对紧密。如果使用这种晶体形式进行Cu2+的浸泡处理，它可能不允许N端重新排列并形成在呈现的Cu2+–ESA结构中观察到的典型ATCUN协调模式。

3.2. ESA中Cu2+结合位点的结构

异常图谱峰值指示了六个Cu2+结合的位置，在这些位置，协调残基足够有序，可以被建模（见图2）。图S5显示了所有Cu2+结合位点的代表性2Fo–Fc电子密度图。如前所述，其中一个位置对应于ATCUN基序（Asp1–Thr2–His3），在那里Cu2+离子采用了平面四配位几何结构。这种排列与高分辨率Cu2+–DAHK肽复合物中报告的排列非常相似（见图S6A），在那里Cu2+由N端胺基、两个脱质子化的酰胺氮和组氨酸的咪唑氮配位。两个基序的结构叠加证实了这种典型的ATCUN几何结构的保守性（见图S6B）。值得注意的是，ATCUN这个术语最初是从对白蛋白的研究中得出的，特别是HSA和BSA，这使得白蛋白成为含有ATCUN的典型蛋白质。虽然之前也报道了其他蛋白质中ATCUN位点的金属结合，主要是Ni2+（见表S2和图S6C），但这是PDB中第二个观察到Cu2+在这样一个位点结合的结构。第一个是在Cu-CA-II（PDB ID：6pdv）中，发现了一个特征性的平面几何结构。据认为，Cu-CA-II中的这个位点可能有助于将电子转移到铜活性位点。

图2

ESA结构中的结合位点和异常信号（RMSD = 3.5）（PDB ID：9zmd）。棕色球体代表Cu2+离子，红色球体代表水分子。结合位点按照残基位置以数字顺序列出。在ESA的B位点也观察到了Cu2+的结合，其中Cu2+还与His9和Asp13侧链的N和O配位，但没有观察到其他配体，这些配体可能来自水分子。A位点的残基也参与了金属结合，Cu2+形成了一个涉及His67、His246、Asp248侧链基团和两个水分子的结合位点。与我们之前的研究结果一致，该研究使用 mutagenesis 结合 EPR 方法检查了 HSA 中的 Cu2+ 结合位点，发现 Cu2+ 与保守的 His287 残基的咪唑氮结合（在 HSA 中为 His288），同时还与 Glu152 的侧链氧结合。Cu2+ 还在 II 和 III 结构域中的不同位点结合。首先涉及的是 Asp211（侧链氧）和 His317（侧链氮），其次是 His509（侧链氮）和 Glu564（侧链氧）。与 B 位点一样，也无法在配位球体中观察到额外的水配体。在 ESA 中参与 Cu2+ 结合的几个残基也被报道在白蛋白晶体结构中结合其他金属离子或含金属化合物（见表 S1）。到目前为止，ATCUN 位点是 Cu2+ 结合所独有的，而 A 位点是一个多功能金属结合位点，也可以结合 Zn2+、Co2+ 和 Pt2+（后者是抗癌药物顺铂的一部分）。B 位点也被报道可以结合 Co2+，而保守的 His287/His288 位点已被证明可以结合顺铂和基于铁的金属化合物。顺铂中的 Pt2+也被观察到可以与不参与 Cu2+ 结合的白蛋白结构中的其他组氨酸残基结合。这些差异可能反映了不同的配位偏好：Pt2+ 是一种对组氨酸和硫供体有强亲和力的软 Lewis 酸，而 Cu2+ 是一种边界 Lewis 酸，通常需要一个多齿配位环境来稳定结合。与目前的结构相比，之前报道的 HSA 与 Cu2+–thiosemicarbazone 和相关含金属化合物复合体的晶体结构显示金属离子与 His146 和/或 His242 结合（见表 S1），这些位置对应于配体结合口袋，而不是生理上的金属离子位点。在这些复合体中，Cu(ii) 中心由有机配体支架预先配位，这决定了对白蛋白配体结合口袋的识别和相互作用，蛋白质仅贡献一个锚定残基来协调 Cu2+ 离子。相比之下，在当前的结构中，自由 Cu2+ 在每个结合位点都由多个蛋白质供体协调。与这种基本的配位化学差异一致，我们没有观察到 ESA 中 His146 或 His242 处有自由 Cu2+ 结合的证据。

3.3. 使用基于 EPR 的方法探测 Cu2+ 与 ESA 的结合

连续波（CW）EPR 光谱被用来研究 ESA 的高亲和力 Cu2+ 结合位点。光谱的双重积分显示，随着添加的 Cu2+ 浓度从 0.5 摩尔当量增加到 5.0 摩尔当量，Cu2+ 信号线性增加（见图 3A）。这种线性表明所有添加的 Cu2+ 都是 EPR 活性的，没有证据表明存在反铁磁耦合的类似三聚体类型的 II 型 Cu2+ 物种。对单个 CW EPR 光谱的检查显示，在添加仅 0.5 摩尔当量的 Cu2+ 时，在大约 3418 G 处出现了一个独特的光谱特征。这个信号归因于最高亲和力的 Cu2+ 结合位点，可能是 N 端的 ATCUN 基序，已知它表现出较低的 g∥ 和较大的 A∥（这里模拟为 g∥ = 2.198 和 A∥ = 607 MHz；见表 S3 和图 S7），与其他符合平面四配位铜的位点相比。值得注意的是，当添加超过 1 摩尔当量的 Cu2+ 时，这个特征并没有进一步增加，表明此时高亲和力位点已完全被占据（见图 3B），这与 HSA 中的情况类似。进一步分析光谱线形状显示，从 0.5–1 摩尔当量的 Cu2+ 开始就已经存在多种 Cu2+ 物种，这与多种配位环境的共存一致（见图 S8、S9 和表 S4）。这些包括氮供体，如组氨酸和咪唑（可能来自 Tris 缓冲液），以及氧供体，与 X 射线晶体结构中观察到的位点一致。因此，伪滴定系列的 CW EPR 数据表明除了 ATCUN 基序外还存在多个具有相似高亲和力的 Cu2+ 结合位点，而最高亲和力的 ATCUN 位点似乎被部分占据，可能是由于一些顺磁金属（例如 Ni2+）的共同纯化，这可以解释为什么早期会出现其他 Cu2+ 被占据的位点。图 3

（A）选定的个别 CW EPR 光谱已标准化并叠加。插图显示了标准化的 Cu2+ 双重积分。（B）ESA 伪滴定系列在约 3418 G 处的独特光谱成分，对应于第一个（高亲和力）结合位点的较低 g 值。（C）在 X 波段频率（9.5 GHz）和场扫描光谱的最大值处获得的 ESA 的代表性（+，+）HYSCORE 光谱，Cu2+ 的浓度分别为 0.5（I）和 5.0（II）摩尔当量。为了探测特定配体的参与，进行了 3-脉冲 ESEEM 实验。得到的光谱显示了在约 0.5–2 MHz 范围内的特征性核四极相互作用（NQI）信号，以及约 4 MHz 处的较宽的双量子（DQ）跃迁（见图 S10）。这些特征与组氨酸残基中的咪唑环中的远程 14N 核有关，证实了它们参与 Cu2+ 的配位。这些发现通过二维超精细亚能级相关（HYSCORE）光谱得到了证实。两个样品分别含有 250 μM ESA 和 0.5 和 5 摩尔当量的 Cu2+，显示出在约 0.5–4 MHz 范围内的弱耦合 14N 核的类似组合峰（见图 3C 和 S11）。此外，HYSCORE数据揭示了随着Cu2+负载量的增加，与水协调的Cu2+物种的数量也在增加，这体现在约14 MHz处信号分裂强度的增加上。10 这表明在ATCUN位点没有与水分子对接的情况，与HSA的情况类似。11

实验获得的脉冲偶极EPR光谱（PDS）距离分布（来自RIDME实验；图4A）显示了几个明显的峰值。我们从结构中提取了所有的铜原子对之间的距离，并将它们列在表S5中。我们进一步基于三个位点同时被占据的模型模拟了距离分布（图4B）。ATCUN位点与位点B之间的距离太短，无法通过PDS可靠地识别，这可能是导致实验中1.5到2.0纳米之间较低距离概率的原因（图4B中的黑色部分）。假设ATCUN位点与位点A和B一样被占据（图4B中的橙色部分），则会在2.0纳米附近产生额外的贡献，但无法解释3.5纳米和4纳米处的实验距离概率。实际上，ATCUN位点与H287处的Cu2+之间的距离与3.5纳米非常吻合（图4B中的蓝色、红色和绿色部分）。这与HSA中H288参与Cu2+结合的情况是一致的。10


图4

(A) 2摩尔当量的Cu2+结合到ESA时的PDS（RIDME）距离分布。距离分布以平均值（黑线）表示，并附有95%的置信区间估计（灰色阴影区域）。颜色条表示可靠性范围（绿色：形状可靠；黄色：平均值和宽度可靠；橙色：平均值可靠）。(B) 实验距离分布（黑色）与2摩尔当量的Cu2+结合到不同组氨酸位点时的模拟距离分布的叠加对比。每种颜色的轨迹代表一种不同的Cu2+占据配置，涉及ATCUN位点、位点B、位点A、His287和His317。在4纳米附近出现的较宽信号可能是由于远端His317位点的占据所致。His317位点与ATCUN位点、位点A和位点B之间的距离都在4.0到4.9纳米之间（图4B中的绿色、品红色、棕色）。值得注意的是，在大多数配置中，ATCUN位点和位点B似乎共存，因为它们的共同占据定义了短到中距离的分布。这与HSA中的情况类似，在HSA中，His9被确定为Cu2+的结合位点，虽然假设了His9在低Cu2+负载时与ATCUN位点的结合，但并未得到明确证明。10 最后，由于His509位点与所有其他位点的距离都在4.5到7.6纳米之间，超出了本实验的距离分辨率范围，因此无法通过这些数据对其进行评估。有趣的是，敲除HSA中的His67并没有显著改变实验中的RIDME PDS距离分布。10 这可能是因为位点A有两个组氨酸配体（ESA/HSA中的His67和His246/His247），如果其中一个被敲除，可能仍会保留一些占据。目前的数据不足以排除任何位点的占据，但至少暗示在2摩尔当量的铜(ii)存在下，His287甚至His317位点可能部分被占据。

4. 结论

总之，本文介绍了结合Cu2+的ESA的X射线晶体结构，揭示了具有平面四方几何结构的强亲和力ATCUN位点。这一发现得益于一种与对称性相关的相互作用，这种相互作用稳定了灵活的N端区域。还识别出了另外五个Cu2+位点，包括位点A和B以及其他涉及组氨酸配体的位点。CW EPR数据支持ATCUN位点存在平面四方配位。ESEEM和HYSCORE技术能够检测到14N信号和四极相互作用，表明组氨酸参与了Cu2+的结合，并且在较高的Cu2+负载量下水的协调作用增强。RIDME距离分布和模拟结果显示了多个位点的同时占据，有强有力的证据表明ATCUN位点和位点B发生了结合，同时远端组氨酸残基也部分参与了结合。这些发现支持了一个多位点Cu2+结合模型，该模型与之前的白蛋白研究结果一致。作者贡献

A. J. S.、B. E. B. 和 W. M. 设计了研究；T. R. 和 B. L. 准备了材料；K. B. H.、M. G.、V. B.、K. A.、A. C.、J. S. 和 B. E. B. 进行了实验（K. B. H.、M. G.、V. B. 和 J. S. 进行了X射线晶体学分析，K. A.、A. C. 和 B. E. B. 进行了基于EPR的实验）；K. B. H.、M. G.、A. P.、K. A.、A. C.、J. S.、C. A. B.、A. J. S.、B. E. B. 和 W. M. 分析和解释了结果；K. B. H.、M. G.、K. A.、A. J. S.、B. E. B. 和 W. M. 撰写了手稿；所有作者都审阅并批准了最终版本。利益冲突

WM参与了最先进的软件、数据管理和挖掘工具的开发；其中一些工具已由HKL Research商业化，并在论文中提到了。WM是HKL Research的联合创始人兼董事会成员。作者除了在论文中披露的关联外，与任何在主题或材料上具有财务利益或财务冲突的组织或实体没有其他相关的关联或财务利益。数据可用性

X射线结构坐标已存放在RCSB蛋白质数据库中，PDB ID为9zmd。相应的原始X射线衍射数据已存放在大分子晶体学可重复性综合资源（IRRMC）中，网址为https://doi.org/10.18430/M39ZMD。EPR光谱数据可在https://doi.org/10.17630/5b97443d-4fed-4b38-b33c-c8915da4fefe获取。补充信息（SI）：原始数据和额外数据。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6qi00150e。致谢

我们感谢使用阿贡国家实验室（Advanced Photon Source）的同步辐射光束线SBC 19-BM进行X射线数据收集。本报告中展示的结果是基于在美国能源部生物与环境研究办公室的支持下，在结构生物学中心进行的工作，该中心由阿贡国家实验室为美国能源部科学办公室运营，合同编号为DE-AC02-06CH11357。这项研究部分得到了弗吉尼亚大学Harrison家族基金和Krystyna Lesiak基金的支持。在波兰国家同步辐射中心SOLARIS进行的研究得到了波兰科学和高等教育部（合同编号1/SOL/2021/2）的支持。EPR设备的资金支持来自英国生物技术和生物科学研究委员会（BB/R013780/1、BB/T017740/1和BB/Z516041/1）。参考文献