《RSC Advances》：Green RP-HPLC method for the simultaneous determination of octenidine and phenoxyethanol in antiseptic formulations: integration of a lean six sigma approach
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研究人员开发了一种绿色且效率导向的反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法，用于消毒制剂中奥替尼啶二盐酸盐（octenidine dihydrochloride）和苯氧乙醇（phenoxyethanol）的同时测定。与以往研究不同，本研究提供了一个完全详细、优化
研究人员开发了一种绿色且效率导向的反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法，用于消毒制剂中奥替尼啶二盐酸盐（octenidine dihydrochloride）和苯氧乙醇（phenoxyethanol）的同时测定。与以往研究不同，本研究提供了一个完全详细、优化并严格验证的等度洗脱方法，在约8分钟的短运行时间内实现同时定量分析。采用Agilent Zorbax氰丙基色谱柱（250 × 4.6 mm，5.0 μm），以乙腈和水（各含0.1%三氟乙酸）按60∶40（v/v）比例组成的流动相，流速为1 mL min?1，检测波长为270 nm，获得了优异的分辨率。该方法对奥替尼啶二盐酸盐的线性范围为0.5–3.0 μg mL?1，对苯氧乙醇的线性范围为3.0–50.0 μg mL?1，并按照人用药品技术要求国际协调理事会（International Council for Harmonisation，ICH）指导原则进行了验证。绿色度评估证实了其低环境影响，而精益六西格玛分析则展示了出色的效率和稳健性。该方法成功应用于纯标准品和商业消毒制剂，证实了其适用于常规质量控制。
**论文解读**
**研究背景与目的**
消毒制剂是用于皮肤表面以降低微生物水平并最小化手术部位感染风险的化学试剂。奥替尼啶二盐酸盐（octenidine dihydrochloride）是一种阳离子表面活性剂，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）具有广谱抗菌活性，其作用机制是非特异性但强效地吸附并作用于细菌细胞壁和膜结构。苯氧乙醇（phenoxyethanol）是一种常用于化妆品和非化妆品产品中的防腐剂，对革兰氏阴性和阳性菌、霉菌和酵母菌均有作用。奥替尼啶二盐酸盐和苯氧乙醇联合使用（通常为0.1%奥替尼啶二盐酸盐和2%苯氧乙醇）作为伤口处理和局部皮肤消毒产品。特别是在COVID-19大流行期间，含奥替尼啶的消毒剂可作为酒精类消毒剂的替代品，因其对包膜病毒具有类似功效，且非刺激性、非过敏性、具持续长达48小时的杀菌效果，并易于大规模配置。
目前存在的问题是，文献检索显示奥替尼啶二盐酸盐和苯氧乙醇虽已在混合物中通过高效液相色谱进行分析，但并非同时测定。此外，这些化合物仅分别与其代谢物或与其他药物组合进行分析。先前的研究分别定量了奥替尼啶二盐酸盐和苯氧乙醇，尚未见报告同时测定二者的经过验证的方法。尽管有一篇出版物同时提及两种分析物，但未提供足够的色谱细节来确认实际的同时分离。因此，本研究的目的是建立一种快速、等度的高效液相色谱方法，能够同时准确量化纯品和商业消毒制剂中的奥替尼啶二盐酸盐和苯氧乙醇，以支持常规质量控制，通过缩短运行时间和减少溶剂消耗来提高分析效率并降低运营成本，并纳入环境可持续性考量以及精益六西格玛评估以确认操作效率和稳健性。
**技术方法**
研究人员采用了反相高效液相色谱技术，使用Agilent 1260高效液相色谱系统（美国Agilent公司），配备四元泵、二极管阵列检测器和50.0 μL定量环的自动进样器。固定相采用Agilent Zorbax氰丙基键合柱（250 × 4.6 mm，5.0 μm）（美国Agilent公司）。流动相由溶液A（含0.1%三氟乙酸的乙腈）和溶液B（含0.1%三氟乙酸的水）按60:40（v/v）比例组成，进行等度洗脱。流速维持在1.0 mL min
?1，紫外检测波长为270.0 nm，进样体积为10.0 μL。分析物奥替尼啶二盐酸盐（纯度99.50%）和苯氧乙醇（纯度99.99%）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。商业消毒制剂样本为Octe-Macro伤口消毒喷剂（批号01，含0.1%奥替尼啶二盐酸盐和2%苯氧乙醇）和Octe-Macro伤口消毒凝胶（批号01，含0.1%奥替尼啶二盐酸盐和1%苯氧乙醇），由Macro Pharmaceuticals生产，购自埃及开罗当地药房。研究人员应用了三种绿色度评估工具：国家环境方法指数（National Environmental Method Index，NEMI）、分析生态量表（analytical eco-scale）和绿色分析程序指数（Green Analytical Procedure Index，GAPI），以及精益六西格玛方法，使用Minitab统计软件（版本14）进行过程能力分析。方法根据人用药品技术要求国际协调理事会（International Council for Harmonisation，ICH）指导原则进行了验证，并评估了系统适用性。
**研究结果**
**3.1 方法开发**
通过广泛的文献回顾发现尚无同时定量两种药物的报告方法，研究人员旨在开发一种在8分钟短运行时间内使用等度洗脱的简单高效高效液相色谱方法。初步尝试使用了常规反相C18和C8色谱柱，但C18柱无法满意地同时分离两种分析物，C8柱虽能分离但峰形过宽且保留时间过长。筛选有机改性剂时发现甲醇导致保留时间延长和峰形不佳，因此选择乙腈作为有机组分，因其具有更强的洗脱能力、改善的峰对称性和更高的色谱效率。鉴于奥替尼啶二盐酸盐是极性化合物，研究人员探索了使用氰丙基键合固定相，该固定相具有多模式保留特性，结合了适中的疏水性和极性相互作用，其氰基可参与偶极-偶极相互作用和弱氢键，这对于保留和分离两种分析物的极性官能团至关重要。用三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）酸化水以增强色谱性能，三氟乙酸作为关键离子对试剂，与质子化的奥替尼啶形成中性复合物以控制其保留并改善峰形。最佳分离在流动相比例为60:40（v/v）、流速1.0 mL min
?1、检测波长270.0 nm下实现，苯氧乙醇和奥替尼啶二盐酸盐的平均保留时间分别为3.8 ± 0.04分钟和7.0 ± 0.02分钟。
**3.2 方法验证**
研究根据ICH指导原则对方法进行了严格验证，评估了线性、特异性、准确度、精密度（重复性和中间精密度）、稳健性、检测限（LOD）和定量限（LOQ）以及系统适用性。方法在奥替尼啶二盐酸盐的0.5–3.0 μg mL
?1和苯氧乙醇的3.0–50.0 μg mL
?1浓度范围内表现出优异线性，回归分析显示出高相关系数（r ≥ 0.999）。精密度评估显示低相对标准偏差（RSD%）值，证实了方法的满意精密度。准确度通过实验室制备混合物和回收率研究评估，证实了高准确度。检测限和定量限通过信噪比方法测定，表明方法具有足够灵敏度。特异性评估显示在溶剂空白、安慰剂基质和商业制剂中，在分析物保留时间处无干扰峰，基线分离充分（分辨率 > 2），且使用二极管阵列检测器进行的峰纯度分析证实了色谱峰的光谱均一性。
**3.2.6 应用于商业消毒喷剂和凝胶**
该方法成功应用于Octe-Macro伤口消毒喷剂和Octe-Macro伤口消毒凝胶中奥替尼啶二盐酸盐和苯氧乙醇的测定，所得结果显示了与标示量相符的高回收率。
**3.2.9 与已报告方法的统计比较**
通过统计比较显示，该方法与已报告方法之间无显著差异，计算得到的t值和F值均低于相应的理论值，表明该方法的可靠性和等效性。
**3.2.10 系统适用性测定**
依据美国药典指导原则评估的系统适用性参数（精密度RSD%、分辨率R、拖尾因子T、容量因子K和理论塔板数N）均符合推荐的可接受标准，确认了色谱系统的充分性能。
**3.3 精益六西格玛技术**
使用Minitab统计软件（版本14）对成品测定数据生成了全面的过程能力六合一分析。统计评估显示出色的过程控制，通过分析20个样本（5个子组）确认了过程稳定性。能力分析表明优化的分析方法始终超过最低过程能力指数（Cpk）阈值1.33，方法对奥替尼啶二盐酸盐实现了1.62的Cpk值，对苯氧乙醇实现了3.74的Cpk值，为方法的稳健性提供了额外验证。
**3.4 方法绿色度评估**
**3.4.1 国家环境方法指数**
该方法在所有四个评估标准上均完全符合绿色化学原则，所用化学品均未被列入持久性、生物累积性和毒性（PBT）物质清单，且所有试剂均不在危险废物分类中。样品pH值保持中性（pH 7），总废物产生量维持在50克以下。
**3.4.2 分析生态量表**
该方法获得92分的分析生态量表（analytical eco-scale）评分，表明其环保性，对健康、安全和环境影响极小。
**3.4.3 绿色分析程序指数**
该方法在大多数方面与绿色化学原则高度一致，GAPI（Green Analytical Procedure Index）象形图中以绿色区域为主，表明低环境影响，但有一个区域为红色（样品制备中使用非绿色溶剂），需要关注，中等影响区域（黄色）可进一步优化以增强可持续性。
**综合讨论**
通过NEMI、分析生态量表和GAPI的综合评估，NEMI确认了方法对绿色原则的基本符合，高生态量表评分（92）数值上验证了其优异的环境性能和操作安全性，而GAPI则识别出可进一步优化的具体方面。这些不同工具的聚合结果提供了多方面验证，证明该方法不仅环境可持续，而且是常规质量控制的更安全、更绿色的替代方案。
**结论**
研究提出的高效液相色谱方法在同时测定奥替尼啶二盐酸盐和苯氧乙醇方面具有显著优势，实现了优异的分辨率和极高的灵敏度，且无彼此干扰或基质干扰。与以往方法不同，它采用等度洗脱，运行时间极短，约8分钟。与已有方法的统计比较未发现显著差异，证实了方法的准确性和可靠性。此外，该方法通过精益六西格玛、NEMI、分析生态量表和GAPI工具的严格评估，证明了其环境友好性和对绿色化学原则的强遵循性。该研究发表在《RSC Advances》上。
**结论部分翻译**：所提出的高效液相色谱方法在同时测定奥替尼啶二盐酸盐和苯氧乙醇方面具有显著优势，实现了优异的分辨率和极高的灵敏度，且无彼此干扰或基质干扰。与以往方法不同，它采用等度洗脱，运行时间极短，约8分钟。与已有方法的统计比较未发现显著差异，证实了方法的准确性和可靠性。此外，该方法通过精益六西格玛、NEMI、分析生态量表和GAPI工具的严格评估，证明了其环境友好性和对绿色化学原则的强遵循性。基于这些优势，所提出的方法高度适用于纯物质和消毒制剂的常规质量控制实验室应用。
