基于离子缔合物检测细菌发酵液中甘氨酸甜菜碱(GB, glycine betaine)的可持续创新型电化学传感器

《RSC Advances》：Sustainable and innovative electrochemical approach for quantifying glycine betaine in bacterial cultures

　　

研究人员研究了制备并优化一种可持续、经济的电化学传感器（GB-CG），用于定量各种细菌培养物中甘氨酸甜菜碱（GB, glycine betaine）的含量。该传感器的设计基于GB与磷钨酸（PTA, phosphotungstic acid）阴离子形成离子缔合物作为离子交换位点，以聚氯乙烯（PVC, polyvinyl chloride）为主要聚合物基质，邻苯二甲酸二辛酯（DOP, dioctyl phthalate）为溶剂介质/增塑剂。该传感器在较宽浓度范围（1×10?7至 1×10?1M）内表现出快速、线性且稳定的能斯特（Nernstian）响应（57.52 mV/decade），检出限（LOD）达 1×10?8M。研究人员从选择性、响应时间、工作寿命及pH/温度工作范围并结合关键验证参数评估了传感器性能。与已报道的高效液相色谱（HPLC）法相比，该传感器可有效测定大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）三种细菌培养物中的GB含量。研究人员还采用三色可持续性评估（TSA, Trichromatic Sustainability Assessment）方案评价了该传感器，以确保其环境相容性、可持续性和实用性。此外，将所提出的传感器与近期报道的GB传感器进行了统计比较，证实了其可靠性和优异性能。

论文解读：基于离子缔合物的甘氨酸甜菜碱细菌发酵液电位型传感器的构建与表征

研究背景与意义

甘氨酸甜菜碱（GB, glycine betaine，又称甜菜碱、三甲甘氨酸、N,N,N-三甲基甘氨酸内盐）是一种小型高极性季铵类渗透保护剂(osmoprotectant)，可在细菌、植物和动物细胞内积累，能稳定细胞膜和蛋白质结构、维持渗透平衡并对抗非生物胁迫。GB在农业抗逆、工业绿色深共熔溶剂(DES/NADES)制备及临床降同型半胱氨酸治疗等领域应用广泛。传统GB来源于甜菜糖蜜提取或化学合成，而利用大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)进行"细菌挤奶(bacterial milking)"生物技术合成成为更具成本效益的替代方案。现有GB定量方法如高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱联谱(LC-MS)和分光光度法存在样品前处理繁琐、仪器昂贵、需专业人员操作等局限，已有电化学传感器尚未应用于复杂细菌发酵液基质且存在制备或实用障碍。因此，研究人员开展了本研究，旨在开发一种可持续、经济、基于电位法的涂膜石墨传感器(GB-CG)，可直接、原位定量细菌培养物中GB含量而无须复杂衍生化或前处理，相关成果发表于《RSC Advances》。

主要关键技术方法

研究人员首先通过电导滴定与元素分析确定GB与磷钨酸(PTA)形成1:1离子缔合物(GB-PTA ion-associate)，将其掺入PVC-DOP基质制备涂膜石墨电位型传感器并进行活化 conditioning。采用分别溶液法(SSM)评估传感器对金属阳离子、结构类似物（胆碱、甘氨酸、二甲基甘氨酸、肉尼汀）及细菌常见基质组分（糖类、氨基酸）的选择性。通过系列GB标准溶液绘制校准曲线，按IUPAC指南评估线性范围、斜率、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、准确度（加标回收率）、精密度(%RSD)、响应时间、适用pH及温度范围、稳定性与寿命。用三种ATCC标准菌株（E. coli ATCC 9637, B. subtilis ATCC 19659, C. glutamicum ATCC 13032）经高盐诱导、超声裂解获取胞内GB提取液，以GB-CG传感器与参照HPLC法平行测定(n=5)并做t检验比对；最后采用分析绿色度指标(AGREE)、蓝色适用性等级指数(BAGI)及RGB12白色分析化学指标进行三色可持续性评估(TSA)，并与已报道GB传感器做统计学对比。

研究结果

Sensor performance evaluation（传感器性能评估）

研究人员按IUPAC指南评估发现，传感器在1×10^?7~1×10^?1M范围内呈线性能斯特响应，斜率为?57.52 mV/decade（接近理论59.1 mV/decade），相关系数r²=0.9996，LOD为1×10^?8M，LOQ为1×10^?7M；准确度(mean±SD)为98.56±0.96%，重复性%RSD为0.322%，中间精密度%RSD为1.122%；适用pH 3–8，响应时间≤10 s，适用温度10–40 ℃，稳定工作寿命达75天。

Optimization of sensor membrane composition（传感器膜组成优化）

研究人员系统考察了不同离子配对剂（四苯硼钠、钼酸、硅钨酸、磷酸三丁酯）及PVC膜中GB-PTA质量分数（5%~30%，PVC:DOP恒为1:1）。结果表明磷钨酸(PTA)因具合适电荷密度、脂溶性、几何互补性与快速可逆离子交换动力学最适；膜最佳组成为GB-PTA 20%、PVC 40%、DOP 40%（w/w），膜厚约1 mm时兼顾响应速度与机械完整性，该配方获最佳能斯特斜率?57.52 mV/decade。

Effect of conditioning time on sensor performance（活化 conditioning时间影响）

研究人员将新制传感器浸入1×10^?1M GB溶液中周期性校准，确定最少活化2 h可在膜表面形成必要凝胶层，使斜率达?57.52 mV/decade且r²=0.9996，故取2 h为最优 conditioning时间。

Sensor selectivity assessment（传感器选择性评估）

研究人员用分别溶液法(SSM)测得所有干扰物的选择性系数(K^pot_GB,X)均<1，其中Na⁺(2.4×10^?2)、Mg²⁺(1.1×10^?3)、胆碱(2.9×10^?1)、甘氨酸(3.6×10^?1)、二甲基甘氨酸(1.2×10^?1)、肉尼汀(carnitine, 1.6×10^?1)，糖类与氨基酸多≤10^?3。传感器对GB的高选择性源于离子-离子载体互补（锁-钥机制）、干扰离子高水合能不利于进入疏水膜、及GB季铵基永久正电荷被PTA^{?特异性识别。}

Sensor response time（传感器响应时间）

研究人员在1×10^?7~1×10^?1M各浓度下监测电位，所有浓度均在10 s内达到±3 mV内稳定读数，且稳定持续≥300 s，表明响应迅速。

Sensor measurement reproducibility（测量重现性）

研究人员交替测定1×10^?3M与1×10^?2M GB溶液各六次，%RSD分别为0.729%和0.515%（均<2%），证明优良的重现性。

Influence of pH on the GB-CG sensor response（pH影响）

研究人员在pH 0.5–12范围测试1×10^?2M GB溶液，传感器在pH≈2.7–8区间响应稳定，推荐操作pH 3–8；pH<3或>8时PTA质子化/去质子化致GB-PTA解离电位漂移。GB季铵基带永久正电荷不随pH变，远端羧基pK_a~1.8，不影响与PTA阴离子交换识别。

Influence of temperature on the GB-CG sensor response（温度影响）

研究人员在5–55 ℃测试，传感器在10–40 ℃电位稳定；低于10 ℃溶液黏度增大限制GB扩散使电位不稳，高于40 ℃加速GB扩散及膜热效应可能缩短寿命，故确定操作温区10–40 ℃。

Sensor stability and lifetime（稳定性与寿命）

研究人员追踪校准斜率75天，斜率保持近能斯特值，确认可稳定工作75天；超期后因动态使用中GB-PTA络合物缓慢浸出及膜机械性质变化致性能衰减。

Method validation（方法学验证）

线性、LOD(1×10^?8M)、LOQ(1×10^?7M)按IUPAC交点法确定；三水平(1×10^?6, 1×10^?4, 1×10^?2M)加标回收率接近100%，日内日间%RSD低，符合方法验证要求。

Application（实际应用）

研究人员对E. coli、B. subtilis、C. glutamicum经0.4%葡萄糖+0.2%氯化胆碱+10% NaCl诱导培养、超声裂解获取的胞内GB提取液(pH调至5.5)进行测定(n=5)：GB-CG法结果为E. coli 15.266±0.079 mg g^?1、B. subtilis 19.015±0.030 mg g^?1、C. glutamicum 23.278±0.123 mg g^?1；参照HPLC法结果为15.349±0.127、18.983±0.275、23.429±0.233 mg g^?1，两组数据无显著差异；标准加入法回收率良好，证明细菌基质无显著干扰，C. glutamicum产GB最高。

Trichromatic sustainability assessment (TSA) for the GB-CG sensor（三色可持续性评估）

绿色度AGREE评分为0.78（满分1），蓝色适用性BAGI为77.5（>60为实用），白色分析RGB12评分为90.0，自动化RGBfast为91，综合表明该方法环境友好、实用性强且具经济性。

A statistical comparison（与已报道传感器统计比较）

与分子印迹(MIP)电化学传感器(Ref. 28, 线性窄、寿命短)、光电化学纳米复合传感器(Ref. 29, 超高灵敏但昂贵复杂)、MWCNT复合膜电位传感器(Ref. 30, 线性窄、LOD差)相比，GB-CG传感器首次专用于复杂细菌发酵液、线性宽(10^?7–10^?1M)、LOD低(10^?8M)、寿命长(75天)、制备简廉、绿色与实用评分高，适合发酵过程现场监测。

讨论与结论总结

研究人员得出结论：本研究成功制备并优化了以GB-PTA离子缔合物为电活性物质的PVC涂膜石墨电位型传感器(GB-CG)，可用于各种细菌培养物中甘氨酸甜菜碱(GB)的直接、原位定量，无需复杂样品前处理。该传感器制备简易（普通石墨棒与常用试剂）、使用成本低，在1×10^?7–1×10^?1M范围内呈线性能斯特响应（斜率?57.52 mV/decade，r²=0.9996），检出限达1×10^?8M，响应时间≤10 s，工作pH 3–8，适用温度10–40 ℃，稳定工作寿命75天，对常见干扰物选择性良好。实际测定三种细菌发酵液中GB含量结果与HPLC法相符。相较已报道GB传感器，GB-CG传感器首次在复杂细菌培养基质中验证，兼具宽线性范围、低检出限、长寿命及优越的绿色与实用性评价指标(AGREE 0.78, BAGI 77.5, RGB12 90.0)，适用于大规模GB微生物发酵的过程监控与高产菌株筛选。未来需在真实生产环境中进一步验证，并探索扩大样本类型及提升传感器耐久性以实现复杂环境下的精确监测。