阐明甲硝唑与胃蛋白酶的相互作用及其药物组合的影响：多种光谱技术和分子建模分析

《Journal of Molecular Structure》：Elucidating the Interaction of Metronidazole with Pepsin and the Impact of Drug Combination: Multiple Spectroscopy and Molecular Modelling Analysis

甲硝唑与胃蛋白酶相互作用机制研究及其与传统中药成分的竞争结合效应分析。采用多光谱技术结合分子模拟方法，系统揭示了MTZ通过静态淬灭作用与pepsin结合，结合常数6.66×103 L·mol?1，主要依赖氢键和范德华力，并导致酶微环境改变及二级结构重组。同时发现MA和FA对MTZ-pepsin结合存在竞争抑制，其中MA直接竞争结合位点，而FA通过改变酶构象间接影响结合。研究为多药联用下胃部药物相互作用机制提供了理论依据。

　　

金向英|贾文超|郭睿|曹永石|谢丹平

中国生态环境部华南环境科学研究院，广州，510655

摘要

小分子化合物（如药物）在人体内的吸收和转运过程受到了广泛关注。胃蛋白酶是一种参与蛋白质消化的蛋白水解酶。在本文中，我们研究了在模拟生理条件下甲硝唑（MTZ）与胃蛋白酶的结合情况。通过荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱、动力学方法、分子动力学（MD）模拟和分子对接技术，探讨了MTZ对胃蛋白酶结构的影响。在不同温度下测定了MTZ-胃蛋白酶复合物的斯特恩-沃尔默猝灭常数（KSV）和结合常数（Ka）。KSV值表明MTZ对胃蛋白酶荧光具有静态猝灭作用。在294 K时，Ka为6.66×10^3 L·mol^-1。多光谱分析表明，MTZ与胃蛋白酶的结合改变了酶的微环境并导致其二级结构发生变化。热力学分析显示，氢键和范德华力是该结合过程的主要驱动力。这些光谱分析结果得到了分子对接和分子动力学模拟的进一步证实。此外，为了研究潜在的多组分相互作用，我们还考察了月桂酸（MA）或阿魏酸（FA）对MTZ与胃蛋白酶结合的影响。本研究旨在阐明这两种来自中药的小分子化合物如何影响MTZ与胃蛋白酶的共结合或功能相互作用，从而为潜在的体内多药联合用药情况提供见解。结果表明，MA和MTZ在胃蛋白酶上存在竞争性结合。同时，MTZ对FA-胃蛋白酶相互作用的影响似乎与微环境的变化或酶的构象变化有关。

引言

抗感染药物的广泛使用显著改善了人类健康，但也加速了抗菌耐药性的产生，并增加了药物相互作用的风险。甲硝唑（MTZ）是一种常用的硝基咪唑类抗菌药物，用于治疗阿米巴病、滴虫病、细菌性阴道病、艰难梭菌感染等厌氧菌感染。它具有快速口服吸收、广泛的组织分布、高生物利用度和良好的安全性[[1], [2], [3]]。然而，口服药物在进入全身循环之前不可避免地会遇到复杂的胃环境。作为胃中的主要消化酶，胃蛋白酶参与蛋白质水解，也可能与某些小分子药物发生相互作用。这些相互作用可能改变药物的可用性、稳定性和后续吸收。因此，系统地研究MTZ与胃蛋白酶在分子水平上的相互作用对于评估其药理性能和潜在的不良反应至关重要[[4], [5], [6]]。近年来，越来越多的研究采用多光谱技术与计算模拟相结合的方法来阐明小分子-生物大分子的相互作用机制，为疾病诊断、治疗和精准用药提供了新的视角[[7], [8], [9], [10]]。

尽管大多数关于MTZ的研究集中在药效学评估和新制剂的开发上，但其与胃蛋白酶的分子相互作用尚未得到系统阐明[[11], [12], [13], [14]]。胃蛋白酶是由胃主细胞分泌的一种消化酶，在酸性条件下被激活，由两个结构相似的域组成，其活性位点包含一个特征性的Asp-Asp催化二聚体，能够在低pH值下高效切割蛋白质[[15]]。近年来，人们对小分子结合对胃蛋白酶结构和功能的影响越来越关注。例如，天然化合物如儿茶素、槲皮素、 crocin和阿魏酸已被证明可以通过氢键和疏水相互作用与胃蛋白酶结合，导致荧光猝灭、构象改变和酶活性的调节。这些效应通过分子对接和分子动力学模拟在结构层面上得到了进一步解释[[16], [17], [18], [19]]。这些研究表明，小分子与胃蛋白酶的相互作用不仅影响酶的行为，还可能改变外源药物的胃稳定性及其与其他配体的竞争性结合，从而导致潜在的药物-药物或药物-食物相互作用[[20,21]]。然而，MTZ是否与胃蛋白酶结合、其结合作用的性质和位置以及对其构象和功能的后续影响仍大部分未得到探索。特别是，整合实验和理论方法的系统分析仍然缺乏。

本研究旨在利用多光谱技术结合分子对接和分子动力学模拟，系统阐明MTZ在模拟胃条件下的结合模式、热力学驱动力和构象效应。此外，我们还研究了MA和FA在多药联合给药时对MTZ-胃蛋白酶结合的竞争性调节作用，探讨这些化合物是否通过占据结合位点或诱导别构变化来减轻潜在影响。本研究首先分析了荧光猝灭行为、结合常数、结合位点和热力学参数，然后利用同步和三维荧光光谱来检测酶的构象变化和供体-受体距离。随后通过计算模拟验证了关键相互作用和复合物的稳定性。最后评估了MA和FA的竞争性结合效应，为潜在的临床联合用药提供了见解。阐明MTZ-胃蛋白酶在分子水平上的结合机制不仅有助于评估MTZ在胃中的分布、保留行为、吸收前的可用性及其与其他配体的竞争性相互作用，还为了解其代谢命运、组织持久性和潜在的药物-药物相互作用提供了分子层面的见解，从而为合理用药、联合治疗设计和减轻不良反应提供了理论基础。

仪器和试剂

仪器和试剂

胃蛋白酶（CAS编号9001-75-6；活性规格：1:3000 U/mg）购自天津大雄化学试剂厂。氯化钾由广州化学试剂厂提供。盐酸购自广东广胜试剂科技有限公司。MTZ（纯度≥99.3%）购自上海桑贡生物科技有限公司。阿魏酸（纯度99%）购自J&K Scientific。月桂酸（纯度≥98%）购自上海S&D标准技术有限公司。

MTZ与胃蛋白酶相互作用的荧光光谱

胃蛋白酶具有来自色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）残基的内源性荧光发射（λEM 345 nm）。在330 nm附近观察到一个小的肩峰，这归因于Trp残基的异质微环境（以及Tyr的次要贡献），而非实验误差[[33]]。当与MTZ结合时，观察到浓度依赖性的荧光猝灭（图1）。这种猝灭是由于MTZ与Trp之间的相互作用引起的。

结论

本研究利用荧光光谱（包括同步荧光光谱和三维荧光光谱）和分子对接模拟来研究MTZ对胃蛋白酶内源性荧光的猝灭效应。此外，还探讨了两种中药成分MA和FA对MTZ与胃蛋白酶相互作用的影响。结果表明，MTZ通过静态猝灭显著降低了胃蛋白酶的内源性荧光。

CRediT作者贡献声明

金向英：撰写——初稿、方法学、实验设计、数据管理。贾文超：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。郭睿：撰写——初稿、方法学、实验设计、数据管理。曹永石：撰写——初稿、方法学、实验设计、数据管理。谢丹平：监督、资源协调、项目管理、资金获取、数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（2023YFC3709702）、广东省基础与应用基础研究基金（资助编号2022A1515110111）、广州市科技创新发展专项资金基础与应用基础研究项目（资助编号202102020479）以及中央政府支持非营利性科研机构基础研究与发展基金（资助编号PM-zx703-202305-234）的财政支持。