《Surface and Coatings Technology》：Thiol-rich titanium implant surfaces via aerosol-assisted atmospheric pressure plasma polymerization
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本研究采用大气压等离子体辅助气溶胶技术，以3-巯丙基三甲氧基硅烷为单体，在Ti6Al4V表面制备均匀硫醇富集涂层，通过SEM、AFM、FTIR和ToF-SIMS表征其结构特性，证实该涂层能快速结合BSA蛋白并保持DNase I酶的高活性，同时显示良好的细胞相容性，为钛合金植入物生物功能化提供了新策略。
M.K. Aktan|D. Zsedényi|L. Yuan|H.F. ?zgüzar|G.I. Geertsema-Doornbusch|N. Mostofi Sarkari|M.G. Srivastava|V. De Maesschalck|R. Lavigne|M.S. Killian|J. Vleugels|H.C. van der Mei|D. Seveno|A. Braem
鲁汶大学（KU Leuven）材料工程系，生物材料与组织工程研究小组，Kasteelpark Arenberg 44，邮政信箱2450，3001，鲁汶，比利时
摘要
在植入物表面工程中，一个主要挑战是在不损害细胞相容性的前提下确保生物活性分子的稳定附着。本研究介绍了一种基于3-（巯基丙基）三甲氧基硅烷（3-MPS）的等离子体聚合中间层，用于在Ti6Al4V表面上固定生物分子。通过气溶胶辅助的大气压等离子体聚合技术，获得了一层均匀的富含巯基的涂层（约35纳米），这一结果通过扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）得到了验证。飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）结合主成分分析显示了独特的化学特征。通过流式电流测量监测牛血清白蛋白的吸附情况，发现其在60秒内迅速结合到表面上。固定的DNase I保持了高酶活性，这一点通过定量DNase测定得到了证实。与人类口腔角质形成细胞和牙龈成纤维细胞的细胞相容性测试表明没有出现细胞毒性。3-MPS等离子体聚合层为钛基植入物的生物功能化提供了一个稳定且可调节的界面。
引言
任何生物材料的植入都会自然破坏局部组织的稳态，并引发一系列被称为宿主反应的分子和细胞事件[1]。这一过程始于血液中的血清蛋白（如白蛋白、纤维蛋白原和维罗尼ectin）迅速吸附到材料表面[2]。这些蛋白质形成了一种临时基质，帮助身体识别植入物并引导免疫细胞和组织细胞到达该位置。这一初始蛋白质层是生物材料与宿主之间的关键接触点，在塑造免疫系统和周围细胞的反应方式中起着重要作用[1][2][3]。
尽管这一生物反应的许多方面仍在研究中，但普遍认为植入物的表面特性（如表面形貌、化学组成、电荷、表面能和润湿性）强烈影响哪些蛋白质会与其结合以及它们的行为[4]。这些特性可以通过调整来促进细胞附着、调节免疫反应或限制细菌生长。事实上，最近的研究表明，通过仔细修改表面，特别是使用定制的化学涂层，可以支持更好的组织整合并降低感染的风险。这些发现突显了表面设计在决定植入材料长期成功中的关键作用[5][6][7]。
在这种背景下，由于其独特的机械强度和生物相容性组合，钛（Ti）及其合金继续被广泛用于各种植入应用[8][9]。它们的优异生物相容性主要归功于暴露在空气中时自然形成的薄氧化层。这层氧化层不仅防止了潜在有害金属离子的释放，还促进了与周围组织的安全相互作用。因此，钛植入物以其能够实现强骨整合而闻名[10]。然而，这种表面与软组织的整合能力有限，可能会影响植入物与周围组织之间的保护性密封[11][12][13][14][15]。为了解决这一限制，研究人员正在探索创新的表面改性策略，以增强钛的生物活性[13][15]。这些方法旨在创建既能促进愈合和组织整合，又能抑制植入物部位细菌附着和生物膜形成的表面[16]。
已经探索了多种修改金属植入物表面的方法[17]，包括湿化学[18][19]、电泳沉积（EPD）[20][21][22][23][24]、溶胶-凝胶涂层[25]、化学气相沉积[5]和等离子体沉积[26][27]。这些策略旨在通过调整表面特性（如化学性质、表面形貌和表面自由能）来改善生物材料的生物性能。在这些方法中，化学功能化（特别是硅烷化）被广泛用于在金属表面固定生物活性剂。硅烷化是最常用的方法，用于功能化金属基底以固定生物分子。各种具有不同末端基团（如-CH?、-NH?或-C(O)C）的硅烷偶联剂被用于钛表面改性[28]。有机功能化的烷氧基硅烷分子可以与钛表面的-OH基团相互作用，充当分子桥梁。例如，钛表面首先用3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES）进行氨基化，然后与4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（Sulfo-SMCC）反应[29]。所得到的马来酰亚胺功能化表面随后暴露于三聚氰胺（一种对多种病原体有效的广谱肽）中，通过半胱氨酸残基的N端建立迈克尔加成反应。这种三聚氰胺涂层的表面减少了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生物膜形成[29]。APTES功能化的钛表面可以生成Ti–O–Si–O–C?H?–NH?结构，引入胺功能团，从而促进抗菌剂的共价附着并抑制细菌定植[30]。如前所述，硅烷化能够引入多种功能团，包括巯基、环氧基和羧基[31]。例如，富含巯基的表面可以与蛋白质或含有巯氨酸氨基酸的肽序列中的半胱氨酸残基形成二硫键[32]。然而，尽管硅烷化应用广泛，但它存在稳定性问题、对溶剂的依赖性以及表面均匀性和可重复性控制有限的问题。
等离子体沉积因其几个关键优势而受到特别关注[33]，例如无溶剂[34]、时间效率高[35][36]、适用于各种导电性的表面[37]，并且能够产生稳定的涂层[26]。值得注意的是，大气压等离子体沉积在常温空气中进行，从而消除了对昂贵复杂真空系统的需求[38]。这使得该过程更易于获取、更具成本效益，并且适用于工业应用。此外，大气压等离子体沉积允许材料的连续在线处理，从而提高制造效率。该技术还提供了对表面处理（如清洁、功能化和活化）的精确控制，使其成为生物医学、电子学和先进涂层等多个领域中的多功能工具[39]。此外，能够在不损害整体性能的情况下控制表面特性，为生物材料领域的特定应用提供了灵活的方法[40]。
等离子体通常被称为物质的第四态，是一种由高浓度各种物种（包括分子、电子、离子和自由基）组成的电离气体[33][41]。当施加足够高的电场时，气体分子会被激发，产生辉光放电。此外，活性气体（如O?、N?、NH?）或惰性气体（如Ar）的活化会导致这些自由基与表面相互作用，从而在表面上接枝化学基团并交联聚合物[26]。等离子体辅助的表面改性和清洁过程可能会影响生物材料表面的氧化程度、硝化、水解和氨基化。因此，这些过程可能导致基团的润湿性和表面能以及表面反应性的变化[42][43]。等离子体辅助技术领域的报道策略包括通过i) 仅使用等离子体活化，ii) 将等离子体聚合涂层作为抗菌剂的储存库[44]并作为抗菌涂层与材料表面之间的中间层以增强附着[45]，或iii) 通过接枝将抗菌剂附着到表面[46][47]来调整表面物理化学和形貌属性[40]。此外，气溶胶雾化源可以生成具有复杂组成的亚微米级液滴[34]。气溶胶耦合的等离子体表面处理可以在钛基表面上引入胺基、羧基和巯基等功能团[34][48]。在钛（Ti）表面上接枝抗菌生物分子可以通过使用硅烷、儿茶酚、磷酸盐、醌和胺等锚定分子来实现持久的附着[32][49]。
在这项研究中，我们提出使用气溶胶辅助的大气压等离子体喷射（APPJ）将3-（巯基丙基）三甲氧基硅烷（3-MPS）接枝到钛（Ti）和钛合金表面上，以生成富含巯基的等离子体涂层，从而增强生物分子的固定。为了优化表面功能化，将调整等离子体工艺参数以实现均匀的涂层性能。通过对所得APPJ处理表面的形貌和物理化学特性进行综合分析，使用扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）来评估表面形态和涂层厚度；使用接触角测量来评估润湿性和表面自由能；使用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）来分析表面化学。将通过研究蛋白质吸附行为、酶固定效率和软组织细胞（包括人类牙龈角质形成细胞和成纤维细胞）的细胞相容性来评估功能化表面的生物性能。特别是，将使用表面Zeta电位分析仪实时监测蛋白质吸附情况，并通过定量DNase测定来评估酶活性。我们假设通过3-MPS等离子体聚合引入富含巯基的功能团将增强生物分子与钛基植入物表面的结合。此外，这一策略可以作为进一步生物功能化的多功能中间平台，实现诸如抗菌表面工程等目标应用。
部分摘录
基底材料
使用从Salomon's Metalen获得的Grade 5 Ti6Al4V合金片（厚度=1毫米）精密切割成10毫米×20毫米的板材，作为实验方案优化的主要基底材料。对于酶测定，使用了商业纯Ti圆盘（cp-Ti，Grade 2，直径=10毫米，高度=2毫米；由Biotech Dental提供）。此外，为了更好地反映临床相关条件，还使用了Grade 5 Ti6Al4V圆盘（直径=9毫米）
等离子体处理后的Ti6Al4V基底的形貌和物理化学性质
研究了等离子体表面改性以改善Ti6Al4V合金表面上生物分子的固定效果。等离子体聚合是一种无溶剂的气相沉积技术，其中有机前体在部分电离的气体（等离子体）中分解，生成自由基、离子、电子和激发物种的混合物，这些物质在基底表面重新组合形成高度交联的薄膜。与传统的湿化学硅烷化方法相比，等离子体
结论
本研究旨在在钛表面上开发一个稳定且多功能的中间层，以支持后续的生物功能化策略。通过使用气溶胶辅助的大气压等离子体聚合3-（巯基丙基）三甲氧基硅烷（3-MPS），在氩等离子体活化的Ti6Al4V表面上沉积了一层均匀的涂层。FTIR和ToF-SIMS的表面分析证实了巯基功能的成功引入，同时涂层表现出一致的形态和有利的
CRediT作者贡献声明
M.K. Aktan：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。D. Zsedényi：方法学，研究，正式分析，数据管理。L. Yuan：方法学，研究，数据管理。H.F. ?zgüzar：研究，数据管理。G.I. Geertsema-Doornbusch：研究，数据管理。N. Mostofi Sarkari：研究，数据管理。M.G. Srivastava：研究，数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了欧盟的Horizon Europe计划（项目编号101091669）、Flanders研究基金会（FWO-Vlaanderen）通过MGS的博士奖学金战略基础研究（1SHFK24N）和中规模研究基础设施资助（I009220N），以及鲁汶大学内部资金（STG/17/024、KA/20/037、KA/22/053、CELSA/23/016）的支持。我们感谢Steven De Feyter教授在AFM测量方面提供的帮助。作者还要感谢Dan Graham的支持。
