《Fermentation》：Improvement of D-Allulose Biocatalysis from D-Glucose in Engineered Escherichia coli by Enhancing Glucose Isomerase Expression and Substrate Supply
Sheng Gao,
Yinuo Li,
Quan Cui,
Chuanzhuang Guo,
Jianbin Wang,
Junlin Li,
Ting Wang,
Piwu Li,
Jing Su and
Han Fan
+ 3 authors
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为了应对传统D-阿洛酮糖化学与酶法合成存在的成本高、副产物多、条件苛刻等问题，研究人员针对以D-葡萄糖为底物的微生物合成途径，通过紫外诱变结合流式细胞术筛选获得高表达葡萄糖异构酶(AGGI)的突变株，优化反应条件构建双酶共表达系统，并利用CRISPR相关转座酶整合高效葡萄糖转运蛋白基因(galP)以增强底物供应。最终工程菌株从20 g/L D-葡萄糖转化D-阿洛酮糖的产率达到15%，显著提高了转化效率，为D-阿洛酮糖的工业化生物合成提供了新策略。
在追求健康饮食的今天，人们既想享受甜食带来的愉悦，又对高热量糖分可能引发的肥胖、糖尿病等健康问题充满忧虑。一种名为D-阿洛酮糖(D-allulose)的稀有单糖成为了焦点。它的甜度约为蔗糖的70%，热量却不足其10%，且具有抗氧化、调节代谢等多种生理益处，堪称新一代理想甜味剂。然而，天然的D-阿洛酮糖在植物中含量极少，难以提取。化学合成法成本高昂、副产物多，而游离酶催化又面临纯化复杂、反应条件严苛的挑战。相比之下，利用工程微生物进行“细胞工厂”式生产，被认为是一条低成本、高稳定性的潜在出路。
从廉价原料D-葡萄糖到D-阿洛酮糖，最短的合成路径仅需两步：首先由葡萄糖异构酶(Glucose Isomerase)将D-葡萄糖异构化为D-果糖，随后由D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase, DAEase)将D-果糖转化为目标产物D-阿洛酮糖。但这两步反应均为可逆反应，受热力学平衡限制，总转化率不高。以往的研究多聚焦于优化下游的DAEase，而对上游第一步反应——即如何高效地将D-葡萄糖转化为D-果糖——的关注相对不足。研究人员推测，如果能够通过工程手段提高中间产物D-果糖的浓度，就可能推动整个反应平衡向生成D-阿洛酮糖的方向移动，从而提升总转化率。为此，发表于《Fermentation》的这项研究，系统性地探索了通过增强葡萄糖异构酶表达与底物供应，来优化工程大肠杆菌合成D-阿洛酮糖的策略。
为开展此项研究，作者运用了几个关键技术方法：首先，采用紫外(UV)诱变结合基于融合荧光蛋白的高通量流式细胞术，从大规模突变库中快速筛选获得了葡萄糖异构酶表达量显著提高的工程菌株。其次，通过分子克隆技术，将筛选到的高活性葡萄糖异构酶(来自Anoxybacillus kamchatkensis G10，简称AGGI)与DAEase共表达于同一工程菌株内，构建了双酶催化途径，并系统优化了共表达体系的全细胞催化反应条件（温度、pH、金属离子）。最后，为了克服底物跨膜运输的限制，研究人员利用CRISPR相关转座酶(CRISPR-associated transposase)系统，将筛选出的高效葡萄糖转运蛋白基因galP以多拷贝形式整合到大肠杆菌基因组中，以增强胞内D-葡萄糖的供应。所有实验菌株均以大肠杆菌BL21(DE3)为出发宿主进行构建。
3.1. 筛选高效D-葡萄糖转运蛋白
研究人员比较了四种不同来源的糖转运蛋白（GalP, MglABC, MalEFG, GlcTUV）对D-葡萄糖和D-果糖的转运能力。通过测定工程菌在单糖或混合糖溶液中的底物消耗率，得出结论：在大肠杆菌中，质子同向转运蛋白GalP对D-葡萄糖的转运效率最高，且在混合底物中对D-葡萄糖表现出明显的选择性，因此被选为后续增强底物供应的候选基因。
3.2. 构建用于荧光筛选的表达质粒
为方便监测葡萄糖异构酶的表达水平，将筛选出的高活性葡萄糖异构酶AGGI与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合表达。构建的融合蛋白表达载体(pET-20b-AGGI-egfp)确保了荧光强度与AGGI表达量呈正相关，为后续高通量筛选提供了可视化的报告系统。
3.3. 通过UV诱变和高通量筛选获得D-果糖转化率提高的突变株
对携带AGGI-eGFP融合表达质粒的原始菌株进行UV诱变，确定了30秒为最佳诱变时间（致死率约90%）。利用流式细胞术，从庞大的突变库中分选出荧光信号显著增强的细胞群体。经过复筛，最终获得一株突变菌株E. coli G12。该菌株表达的AGGI酶活达到26.83 U/mL，是原始菌株的4.55倍。在全细胞催化中，其将D-葡萄糖转化为D-果糖的转化率在6小时达到51.2%。
3.4. 共表达AGGI和DAEase用于D-阿洛酮糖合成
将AGGI和DAEase的基因克隆到双表达载体pCDFDuet-1上，并转入E. coli G12宿主，构建了可一步转化D-葡萄糖为D-阿洛酮糖的工程菌E. coli G12/pCDFDuet-1-AGGI-DAE。由于两种酶的最适反应条件不同，研究人员对全细胞催化体系的条件进行了优化。最终确定最适反应条件为65°C， pH 8.0，并添加1 mM Co2+。在此条件下，该工程菌从20 g/L D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的转化率为11.2%。
3.5. 增强底物供应以提高D-阿洛酮糖转化率
为了进一步提高底物D-葡萄糖的胞内供应，研究人员利用CRISPR相关转座酶系统，将galP表达盒以多拷贝形式整合到宿主菌E. coli G12基因组的多个位点，构建了基因组强化菌株E. coli P5。再将双酶表达质粒转入该菌，得到最终工程菌E. coli P5/pCDFDuet-1-AGGI-DAE。全细胞催化实验显示，该菌能更快速地消耗D-葡萄糖并积累D-果糖，最终将D-阿洛酮糖的转化率提升至15%，较未强化底物供应的菌株提高了3.8%。
本研究通过系统性的工程改造，成功验证了增强葡萄糖异构酶表达及底物供应对于提高D-阿洛酮糖合成效率的关键作用。研究结论指出，在从D-葡萄糖合成D-阿洛酮糖的两步酶促途径中，上游的葡萄糖异构酶催化步骤是限制整体转化效率的重要因素。通过UV诱变与高通量流式筛选，可以获得葡萄糖异构酶表达量大幅提升的宿主菌，从而显著提高中间体D-果糖的产量。进一步将高效葡萄糖转运蛋白基因galP整合至基因组，可以增强底物D-葡萄糖的胞内供应，驱动反应平衡，最终提升D-阿洛酮糖的产率。尽管15%的转化率仍受限于酶促反应的热力学平衡及双酶活性匹配等问题，但这项工作清晰地阐明了一条有效的代谢工程优化路径：即通过增强限速步骤的酶活力和底物输入，可以有效推动多步生物催化反应向目标产物方向进行。
该研究的意义在于，它不仅为D-阿洛酮糖的微生物法生产提供了一株具有更高转化效率的工程菌株和一套可行的强化策略，更重要的是，它展示了一种通用的合成生物学研究思路：对于涉及多步反应的生物合成途径，在优化下游关键酶的同时，对上游反应步骤及底物传输系统的协同强化，可能带来意想不到的全局性收益。这为其他高附加值稀有糖或天然产物的微生物制造提供了有价值的参考。未来，通过蛋白质工程改造以获得催化特性更匹配的双酶组合、精细调控双酶的表达比例、以及促进产物转运以减少反馈抑制等策略，有望进一步突破转化瓶颈，推动D-阿洛酮糖生物合成技术的工业化应用。
