《Analytica Chimica Acta》：CbAgo-enriched Cas12a biosensor for cancer mutations screening
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精准检测低频DNA突变体在体液中的存在对癌症监测和治疗评估至关重要。本研究提出一种新型检测系统CECMS，通过整合Clostridium butyricum Argonaute（CbAgo）与CRISPR-Cas12a，选择性清除野生型DNA并富集突变体。该系统在37℃环境下灵敏度提升100倍，可检测0.01%变异等位基因频率（VAF），并成功在未稀释血清中检测到胰腺癌相关KRAS G12D突变（VAF 0.1%）。实验采用单一步骤整合酶促反应，简化了检测流程，同时模块化设计支持多种突变检测。
作者：翟希文、杨碧瑶、邓飞、古拉蒂斯·斯内哈、麦金奈瑞·弗林、吴轩、李毅、戈尔迪斯·埃娃·M.
澳大利亚新南威尔士大学工程学院生物医学工程系，纳米生物光子学卓越中心，新南威尔士州2052
摘要
背景
准确检测体液中的低频DNA突变对于癌症监测和治疗评估至关重要。然而，野生型DNA的丰富存在往往掩盖了罕见的突变信号，使得敏感检测变得特别具有挑战性。
结果
我们开发了一种名为“CbAgo富集的Cas12a突变检测系统（CECMS）”的筛查策略。通过将CbAgo的单核苷酸分辨率与CRISPR-Cas12a的转切活性相结合，该系统能够选择性地消除野生型DNA，同时富集目标突变等位基因。与传统的Cas12a生物传感器相比，CECMS在37°C时的灵敏度提高了100倍，从而能够可靠地检测到低至0.01%的变异等位基因频率（VAF）。在未稀释的血清样本中，该方法成功检测到了胰腺癌相关的KRA S G12D突变，其VAF为0.1%。
意义
通过利用CbAgo介导的富集作用，显著提高了暴露罕见SNV以供下游检测的能力。凭借其高效率和易用性，CECMS作为临床癌症诊断和监测的工具具有巨大潜力。
引言
循环肿瘤DNA（ctDNA）由肿瘤细胞释放到血液中的无细胞DNA片段组成。ctDNA经常携带与癌症发展相关的特定遗传变异，如单核苷酸变异（SNVs）[1]。在胰腺导管腺癌（PDAC）中，G12D变异是KRAS基因中最常见的突变之一，大约30-50%的病例中存在这种突变[2]。这种突变会促进强烈的致癌信号传导，并与不良临床结果相关[3]。对ctDNA中KRAS G12D的敏感和特异性检测对于治疗选择、疾病监测以及可能早期发现胰腺癌患者具有重要意义[4],[5]。
目前检测SNVs的方法包括下一代测序（NGS）、滴液数字聚合酶链反应（ddPCR）和扩增抗性突变系统聚合酶链反应（ARMS PCR）[6],[7],[8]。NGS能够高效地分析整个基因组，但成本相对较高[9],[10],[11],[12]，并且在样本制备过程中的错误可能会影响NGS的准确性[13]。ddPCR和ARMS PCR在检测罕见突变方面具有出色的灵敏度和准确性，但ddPCR成本较高，而ARMS PCR的工作流程较为复杂[14],[15]。尽管这些方法是当前ctDNA检测的基础，但它们对复杂设备和专业知识的依赖限制了其在大规模筛查和长期临床监测中的应用[16],[17]。
凭借其高度敏感和特异性的核酸检测能力，CRISPR-Cas传感器最近被用于SNVs的检测[18],[19],[20]。一种直接的方法利用PCR扩增来富集突变序列，减少野生型的干扰，从而促进Cas酶的准确切割[21]。故意错配的CRISPR RNA（crRNA）进一步提高了检测单核苷酸差异的特异性[22]。基于CRISPR的SNVs检测技术相比传统的PCR和NGS方法具有多项显著优势，它们具有简化的检测流程，并且在等温条件下运行，因此非常适合快速突变筛查。然而，基于CRISPR的检测方法的一个关键挑战是从大量的野生型背景中区分出罕见的癌源突变DNA。在早期癌症中，突变等位基因的比例（VAF）可能低至0.01%[20],[23],[24]。这种微小的差异显著增加了突变检测的复杂性，给使用CRISPR生物传感进行准确和敏感的癌症诊断带来了重大挑战。
原核Argonaute蛋白（pAgos）是一类新的可编程核酸酶，已在目标DNA切割中表现出精确的单核苷酸特异性，能够准确切割野生型DNA并富集样本中的罕见突变[24],[25]。在镁或锰离子的存在下，pAgos会结合5'端修饰有磷酸（P）或羟基（OH）的短DNA/RNA引导序列[26],[27]。引导序列通常为15-40个核苷酸，指导pAgo切割互补的DNA目标[28]。pAgo核酸酶在较宽的温度范围内起作用，通常在引导序列的第10到第11个核苷酸之间切割目标[25],[29],[30],[31],[32],[33]。与Cas12a或Cas13a不同，pAgo核酸酶不需要protospacer相邻基序（PAM）序列。这一独特特性使得可以针对整个基因组序列中的特定位点进行检测，这对于开发多功能和灵活的分子检测工具特别有价值[34]。NAVIGATER策略[30]利用Thermus thermophilus Argonaute（TtAgo）和PAND系统[35]（整合了Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）），在高温下有效富集突变等位基因，从而增强下游检测的信号输出。这些pAgos已被证明是检测单核苷酸突变的理想工具。
在这项研究中，我们开发了一种新型且简单的突变检测方法——CbAgo富集的CRISPR-Cas12a突变检测系统（CECMS），该系统将Clostridium butyricum Argonaute（CbAgo）与CRISPR-Cas12a结合。CbAgo是一种在中等温度下工作的pAgo类型[33]。在该系统中，CbAgo-gDNA复合物在37°C时特异性地靶向并切割野生型DNA，有效富集突变DNA，最小化野生型DNA对下游反应的干扰。然后，富集的突变DNA可以被专门设计的CRISPR-Cas12a系统识别，产生针对突变的放大荧光信号。我们的研究结果表明，CECMS系统能够检测到低至0.01%的KRAS突变，其灵敏度比传统的Cas12a传感器提高了100倍。此外，该系统在添加了ctDNA的血清样本中也能可靠地识别出0.1%的KRAS突变。这两种酶促反应已被整合到CECMS系统的单管反应中，大大简化了整个检测过程，证明这是一种快速且用户友好的方法，可用于准确检测SNVs。这些结果展示了CECMS平台作为低成本和快速检测工具的潜力，可用于筛查ctDNA中突变水平的变化，对癌症患者的术后监测、治疗效果评估等具有益处。此外，CECMS系统的模块化设计使其易于适应检测多种KRAS突变，满足了精准肿瘤学的关键需求。
部分摘录
核酸制备
所有DNA序列均由Gencefe合成，详细序列见表S1。71个核苷酸的双链DNA是由两条互补的单链DNA（ssDNA 1和ssDNA 1c；ssDNA 2和ssDNA 2c）合成的。退火条件如下：在95°C下加热5分钟，然后每秒降低0.1°C，直至达到25°C。通过混合野生型DNA和突变DNA来制备不同VAF水平的KRAS G12D突变样本，突变比例为0%
CbAgo富集的CRISPR-Cas12a罕见突变检测系统示意图
传统的基于CRISPR-Cas12a的罕见突变检测受到高浓度野生型DNA和野生型DNA与突变DNA之间微小单核苷酸差异的显著阻碍。这一挑战限制了CRISPR-Cas12a系统实现所需高灵敏度的能力。为了解决这个问题，本研究采用了同时使用CbAgo和Cas12a的联合策略。如图1所示，在CbAgo富集阶段
结论
总之，本研究开发的CECMS系统为富集和检测罕见SNV突变提供了一种新颖有效的方法。整个反应在37°C下进行，使得程序简单且适用于温和的条件。通过结合CbAgo的高精度单碱基识别和切割能力，该方法显著减少了野生型DNA的干扰，使整合的CRISPR-Cas12a能够准确识别突变DNA
CRediT作者贡献声明
邓飞：研究、数据管理。古拉蒂斯·斯内哈：撰写 – 审稿与编辑。麦金奈瑞·弗林：撰写 – 审稿与编辑。吴轩：撰写 – 审稿与编辑。杨碧瑶：研究、数据管理。翟希文：撰写 – 初稿撰写、验证、方法学设计、概念构建。李毅：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学设计、概念构建。戈尔迪斯·埃娃·M：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了新南威尔士大学E.M. G.的SHARP计划以及国家健康与医学研究委员会（NHMRC）Ideas资助（APP2030464）的支持。我们还要感谢新南威尔士大学重组产物设施在生产和纯化本研究中使用的蛋白质方面提供的帮助。
