《Bioresource Technology》：Host analysis-guided selection and targeted engineering (HASTE) of Lipomyces tetrasporus for the conversion of CO
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本研究鉴定出新型脂质酵母Lipomyces tetrasporus NRRL Y-11562，能有效利用醋酸、葡萄糖和木糖等混合碳源。通过13C代谢通量分析、代谢组学和RNA测序，揭示了其代谢灵活性和高苹果酸合成能力。工程化后，摇瓶中苹果酸产量达7.5 g/L，fed-batch中达28.8 g/L，验证其作为生物制造底盘的潜力。
郑阳·肖（Zhengyang Xiao）| 杰弗里·J·察伊卡（Jeffrey J. Czajka）| 贾斯敏·阿尔瓦雷斯（Jasmin Alvarez）| 尤英（Ying Yu）| 王赵曦（Zhaoxi Wang）| 戴子宇（Ziyu Dai）| 邓双（Shuang Deng）| 特蕾莎·莱蒙（Teresa Lemmon）| 玛丽·斯维塔（Marie Swita）| 苏曼特·潘迪（Sumant Pandey）| 董杰（Jie Dong）| 姜峰（Feng Jiao）| 唐银杰（Yinjie J. Tang）| 凯尔·R·庞兰宁（Kyle R. Pomraning）
美国密苏里州圣路易斯市华盛顿大学能源、环境与化学工程系，邮编63130
摘要
具有成本竞争力的生物生产需要利用来自二氧化碳电还原的纤维素糖或醋酸。在这里，我们发现了一种新型的Lipomyces tetrasporus菌株（即来自24种Lipomyces物种的NRRL Y-11562），该菌株能够有效利用多种底物（醋酸、葡萄糖和木糖）。我们通过综合13C代谢通量分析、代谢组学分析以及基于大型语言模型的数据处理技术，对这种新的底盘菌株进行了表征。在醋酸代谢过程中，L. tetrasporus表现出高度活跃的TCA循环、快速的柠檬酸和苹果酸积累、较强的NADH/NADPH生成能力以及乙酰辅酶A合成酶活性。此外，这种具有负油性的酵母在受压条件下（例如氧气限制和抑制剂存在的情况下）对糖类与醋酸或富含醋酸的电催化溶液的共利用具有很强的代谢灵活性，并且在葡萄糖和醋酸共转化过程中，超过70%的代谢通量通过氧化戊糖磷酸途径，这一比例高于模式酵母如Saccharomyces cerevisiae和Yarrowia lipolytica。利用这些代谢见解，我们对L. tetrasporus进行了工程改造，使其能够在摇瓶培养中产生7.5克/升的苹果酸（产率0.25克/克葡萄糖），并在玉米秸秆水解物的连续培养中产生28.8克/升的苹果酸（产率0.20克/克葡萄糖）。
引言
近年来，生物制造原料的多样化，如来自厌氧消化的挥发性脂肪酸、电还原产生的富含醋酸的流体以及木质纤维素水解物，要求微生物宿主能够稳健地代谢混合底物，并耐受工业操作中常见的抑制剂和渗透压应力。例如，二氧化碳电还原可以生成适合发酵的含醋酸溶液，但杂质和工艺条件可能会对生长产生强烈抑制，因此需要耐受性强的底盘菌株（Crandall等人，2023年）。同样，玉米秸秆水解物含有混合的C5/C6糖类和抑制性化合物，这需要具有代谢灵活性和抗压能力的宿主（Guo等人，2022年；Yang，2018年）。对于复杂的原料，选择具有天然降解碳源特性的宿主并且对抑制剂具有耐受性的微生物，比广泛重新编程模式宿主更为有效。尤其是由于经过大量改造的宿主通常会面临较高的代谢负担、降低的抗压能力和突变问题。为了解决这些问题，我们开发了“基于宿主分析的筛选和定向工程”（HASTE）工作流程，以识别和开发能够实现可扩展生物生产的宿主（图1）。
在这里，我们选择关注非常规的油性酵母，因为它们由于天然特性而成为生物制造平台的理想选择（McNeil和Stuart，2018年；Angerbauer等人，2008年；Wang，2016年；Lin等人，2011年；Zhang等人，2021年；Matsakas等人，2014年；Yamauchi等人，1983年；Tsakona，2014年）。Lipomyces属的微生物特别有潜力，因为它们能够在营养受限条件下积累高水平的细胞内脂质（Sutanto等人，2018年；Takaku等人，2020年），其含量常常超过干重的60%（Czajka，2024年；Jacob和Mathew，2023年）。Lipomyces可以在多种底物和废弃物原料上生长（Czajka，2024年；Bruce等人，2016年；Pomraning，2019年），并且对相对较低的pH值具有耐受性（Brandenburg，2016年）。在对18个菌株的比较研究中，L. tetrasporus是产脂量最高的菌株之一（在葡萄糖培养条件下可产生约21克/升的脂质），并且能够将混合糖类生物质水解物高效转化为富含C16～C18脂肪酸的三酰甘油（TAG）（Bruce等人，2016年）。由于Lipomyces属微生物能积累富含C16和C18脂肪酸的TAG，它们成为生产水解酯类和脂肪酸途径燃料（Marchesan，2025年）以及增值油脂化学品和类似可可脂的脂质的理想微生物平台，因为可可脂主要由C16和C18脂肪酸的三酰甘油组成（Wei等人，2017年）。L. tetrasporus可以从未脱毒的生物质水解物中消耗C5和C6糖类，并产生17.6克/升的脂质（Chen等人，2021年；Caporusso，2023年）。研究表明，它在木质纤维素水解物上的脂质产量也高于L. starkeyi（Caporusso等人，2025年）。由于其在脂质和乙酰辅酶A生产方面的强大代谢能力，L. tetrasporus正成为可持续生物生产的理想底盘菌株。
尽管Lipomyces属微生物具有潜力，但它们仍不如模式酵母受到充分研究（Wang，2016年），对其遗传特征的研究和工程改造也才刚刚开始（Calvey等人，2014年）。在此背景下，本研究将HASTE方法应用于Lipomyces菌株和物种，以解决二氧化碳衍生原料的生物转化问题。我们选择了L. tetrasporus NRRL Y-11562菌株，并研究了该菌株利用可持续原料的能力，特别是来自二氧化碳电催化还原的混合底物（如糖类和醋酸）（Crandall等人，2023年；Kohansal Moghadam等人，2025年；Nitopi，2019年；Vennek?tter等人，2019年）以及玉米秸秆水解物（含有C5/C6糖类的混合物）（Chen，2016年）。然后，我们通过13C代谢通量分析（MFA）、动态同位素标记实验和比较RNA-seq转录组学对其代谢途径进行了功能注释和调控响应分析。这些新发现促进了L. tetrasporus的定向工程改造，使其能够从多种碳源高效生产苹果酸。最终，建立的代谢工程和生物过程优化知识将有助于推动L. tetrasporus NRRL Y-11562作为新一代二氧化碳衍生原料生物制造底盘的发展。
菌株培养和培养基组成
选择NRRL Y-11562菌株进行通量分析、动态标记和菌株工程改造。Y. lipolytica PO1f（ATCC MYA-2613）、S. cerevisiae S288C（ATCC 204508）以及其他Lipomyces属菌株（NRRL Y-11562、NRRL Y-8875、NRRL YB-3534、NRRL Y-11558、NRRL Y-11560、NRRL Y-27494、NRRL Y-27495、NRRL Y-27504、NRRL Y-27493、NRRL Y-11553、CBS 7536、CBS 7851、CBS 8064、CBS 8552、CBS 8726、CBS 10300、CBS 7786、CBS 7532、Phaff 78-23、Phaff 78-24、Phaff 55-103、Phaff 51-55等）也被用于研究。
Lipomyces菌株在二氧化碳衍生原料上的生长筛选
Lipomyces属微生物因其代谢灵活性（Czajka，2024年；Riley，2016年）以及能够有效转化二氧化碳衍生原料（如醋酸和木质纤维素水解物）的能力（Pomraning，2019年；Czajka，2025年），成为工业生物转化的理想宿主。为了扩展这一属的应用范围，我们筛选了能够在短二氧化碳和废弃物衍生原料（甲醇、甲酸、醋酸和丙酸）以及常见抑制剂存在下生长的Lipomyces物种和分离株。
葡萄糖和木糖利用过程中的代谢和转录重编程
我们使用13C-MFA技术分析了L. tetrasporus NRRL Y-11562在使用不同碳源时的中心代谢通量（图3）。当以葡萄糖作为唯一碳源时，L. tetrasporus将大量碳通量（即79%来自葡萄糖-6-磷酸）导向氧化戊糖磷酸（OPP）途径（图3a），比Y. lipolytica高出约60%（Wasylenko等人，2015年）。这表明L. tetrasporus具有强大的NADPH生成能力，以支持生物质合成。
共底物利用减少代谢刚性并促进苹果酸合成
当以醋酸作为唯一碳源时（图4b），L. tetrasporus NRRL Y-11562的OPP途径通量约为Y. lipolytica的50%（Xiao，2025年；Wasylenko等人，2015年），这可能表明其葡萄糖异生能力有限。这一限制对于生物过程设计至关重要，因为它表明醋酸的利用严重依赖于替代碳源（葡萄糖或木糖）来维持生物质合成。值得注意的是，共利用实验（图4a）显示...
结论
本研究强调了L. tetrasporus NRRL Y-11562作为下一代生物转化底盘的潜力，因为它天然具有对抑制化合物和渗透压的耐受性以及代谢灵活性。我们的结果表明，该菌株在多种二氧化碳衍生碳源（包括葡萄糖、木糖和醋酸）下都能产生稳定的能量，并能有效将碳导向有机酸的生物合成。基于代谢分析，我们进行了定向菌株工程改造。而不是依赖...
CRediT作者贡献声明
郑阳·肖（Zhengyang Xiao）：撰写——初稿、研究、概念化。
杰弗里·J·察伊卡（Jeffrey J. Czajka）：撰写——审阅与编辑、研究、概念化。
贾斯敏·阿尔瓦雷斯（Jasmin Alvarez）：撰写——审阅与编辑、研究。
尤英（Ying Yu）：撰写——审阅与编辑、研究。
王赵曦（Zhaoxi Wang）：撰写——审阅与编辑、研究。
戴子宇（Ziyu Dai）：撰写——审阅与编辑、研究。
邓双（Shuang Deng）：撰写——审阅与编辑、研究。
特蕾莎·莱蒙（Teresa Lemmon）：撰写——审阅与编辑、研究。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究的部分工作得到了美国国家科学基金会（NSF）的资助，项目编号为#2225809和#2330245。部分工作由太平洋西北国家实验室（PNNL）在Agile BioFoundry（agilebiofoundry.org）的支持下完成，该计划得到了美国能源部（DOE）关键矿物与能源创新办公室（CMEI）和替代燃料与原料办公室（AFFO）的资助，依据协议2.5.3.722a。PNNL由美国能源部运营。
