基于纸张的单酶双底物检测方法，用于快速检测和区分大肠杆菌（E. coli）及其O157:H7血清型

《Biosensors and Bioelectronics》：Paper-Based Single-Enzyme Dual-Substrate Assay for Rapid Detection and Differentiation of E. coli and E. coli O157:H7

基于纸基双底物显色法与机器学习的E. coli及其O157:H7检测新策略，实现快速（20分钟）可视化与定量区分，检测限达103 CFU/mL，适用于低成本、环保的现场诊断。

　　

Madhurima Borah | Archana Yadav | Jyoti Lakshmi Hati Boruah | Hemant Sankar Dutta

分析化学与SAIF小组，化学科学与技术部，CSIR-东北科学技术研究所（CSIR-NEIST），Jorhat 785006，印度

摘要

大肠杆菌

通常是无害的，但产生志贺毒素的菌株（如O157:H7）可引起严重疾病，这突显了快速、低成本、可在现场使用的检测方法的需求。在这里，我们介绍了一种基于纸张的双底物比色检测方法，并结合了机器学习技术，用于同时检测和区分大肠杆菌（E. coli）和O157:H7型大肠杆菌（E. coli O157:H7）。该检测方法使用两种对β-半乳糖苷酶有反应的底物：X-gal和CPRG。这些底物利用了菌株特异性的酶亲和力，从而在20分钟内产生明显的颜色变化：大肠杆菌呈现绿色，而O157:H7型大肠杆菌呈现品红色。这是首个能够同时实现视觉和定量区分大肠杆菌菌株的单酶双底物系统。该检测方法在商用和基于纸张的96孔板上表现相当，具有相同的检测限和检测时间。纸张格式使用的试剂量减少了十倍，产生的废物也更少，并且允许预先涂布试剂，简化了工作流程，只需一步添加样本即可完成检测。在纯培养物中，该检测方法的检出限（LOD）为10^3 CFU/mL，并能在20分钟内区分浓度为10^6 CFU/mL的菌株；在富集的食品样本中，检出限为10 CFU/mL。吸光度和比率分析表明650/574和574/650的比值具有最高的区分能力，这一结果得到了主成分分析（PCA）和变量重要性分析的支持。AGREE评估（0.86）证实了这种纸质检测设备的优越性。总体而言，该检测方法提供了一种快速、经济、灵敏且环保的病原性大肠杆菌检测平台，具有在食品和水源监测中广泛应用的潜力。

引言

大肠杆菌（E. coli）是一种常见于人类和其他温血动物肠道中的共生细菌，大多数菌株是无害的。然而，某些菌株可导致人类和动物的疾病，如乳腺炎、胃肠炎和食物中毒（Mueller & Tainter, 2025; Makvana & Krilov, 2015; Wang et al., 2025）。其中，产生志贺毒素的大肠杆菌（STEC），尤其是O157:H7血清型，对公共卫生构成了重大威胁。感染通常会导致腹痛和腹泻，可能发展为出血性结肠炎、发热或呕吐。大约10%的病例会发展成溶血性尿毒综合征（HUS），这是一种危及生命的疾病，其特征是急性肾功能衰竭、溶血性贫血和血小板减少，死亡率约为3-5%（Joseph et al., 2020; Ville et al., 2019; Li et al., 2024; Zheng et al., 2023）。STEC感染主要通过受污染的食物和水传播。根据世界卫生组织（WHO）的数据，每年约有6亿人患有食源性疾病，导致约42万人死亡，其中5岁以下儿童占病例的近40%。食品污染每年还造成约1100亿美元的全球经济损失（WHO; WHO EMRO）。欧洲疾病预防控制中心（ECDC）指出，HUS是儿童急性肾功能衰竭的主要原因，常伴随长期肾脏损伤或神经系统并发症。STEC可以在粪便、沉积物和水环境中长期存在，从而促进食源性和水源性疫情的爆发（ECDC, 2024; ECDC, 2012）。全球已报告多起STEC O157:H7疫情，包括1993年的Jack in the Box牛肉事件、1996年的Odwalla苹果汁事件、2023年的卡尔加里托儿所疫情、2024年的英国沙拉相关疫情以及美国的洋葱相关病例（CDC; FDA）。在印度，南印度、加尔各答、查谟和克什米尔以及旁遮普等地区也记录了多次水源性疫情，表明受污染的肉类和不安全的水是主要的传播途径（NCDC, 2024; Ray, 2025）。鉴于大肠杆菌菌株的致病潜力各不相同，快速检测和准确区分对于有效预防疾病、食品安全监测和公共卫生控制至关重要。

传统方法如培养检测、PCR和ELISA具有高灵敏度和特异性。然而，这些方法耗时、劳动密集且需要专门的基础设施，这限制了它们在资源匮乏或现场环境中的使用。近年来，基于电化学、光学、纳米材料和CRISPR-Cas系统的生物传感器平台显示出显著提高的灵敏度和选择性（Bai et al., 2022; Pebdeni et al., 2022; Razmi et al., 2020; Wu et al., 2012; Pandey et al., 2017）。特别是基于纳米粒子的生物传感器由于其高表面积、出色的信号放大能力和独特的物理化学性质而提升了检测性能（Gai et al., 2023; Zhang et al., 2023; Zhu et al., 2022）。尽管取得了这些进展，但高昂的成本、复杂的制造过程、脆弱的生物识别元件以及对精密仪器的依赖阻碍了它们的广泛应用。因此，特别是在易发疫情的地区，迫切需要经济实惠、坚固、便携且可扩展的生物传感器（Xue et al., 2025; Gao et al., 2025）。

基于纸张的分析设备（PADs）成本低廉、便于携带，非常适合资源有限的场景中的快速检测。它们所需的样本量极少，支持比色或电化学读数，可以通过视觉或智能手机进行解读。PADs可大规模生产、稳定性好，并能实现多重检测，使其成为监测病原体（如大肠杆菌）的理想平台（Li et al., 2023; Borah & Dutta, 2025a; Abbas et al., 2023; Borah & Dutta, 2025b）。在基于微流控技术的PADs用于大肠杆菌检测方面已取得显著进展。最近的研究包括一种基于多克隆大肠杆菌抗体的柔性电化学纸生物传感器与多壁碳纳米管的结合，以及一种使用羧基化氧化石墨烯的低成本电化学检测方法用于O157:H7的检测（Ozoglu et al., 2025; Du et al., 2025）。Pan等人（2025）开发了一种三聚氰胺泡沫比色生物传感器，可在1.5小时内检测到浓度为10 CFU/mL的O157:H7；Wu等人（2023）报道了一种基于荧光噬菌体的纸生物传感器用于食源性O157:H7的检测（Pan et al., 2024; Wu et al., 2023）。2019年，Kim等人介绍了一种基于纸张的设备，利用双底物酶实现O157与非O157菌株的区分（Kim et al., 2019）。

人工智能（AI）驱动的生物传感技术正吸引越来越多的关注。然而，将机器学习（ML）应用于基于纸张的比色检测中的病原体区分仍较为有限。ML可以从比色和吸光度数据中提取难以通过视觉识别的细微模式，从而提高生物传感器的准确性。当与吸光度和颜色分析结合使用时，ML可以使基于纸张的检测方法生成可靠的定量结果，并实现菌株级别的区分（Harris, 2023; Xu et al., 2025; Banicod et al., 2025; Ma et al., 2023）。

在这项研究中，我们报告了一种结合了机器学习的基于纸张的比色检测方法，用于检测和区分大肠杆菌（E. coli）和O157:H7型大肠杆菌（E. coli O157:H7）。先前的研究表明，O157:H7产生的颜色反应比非O157菌株更强，表明其β-半乳糖苷酶活性更高（Kim et al., 2019）。为了验证这一点，我们使用了两种对β-半乳糖苷酶具有特异性的显色底物X-gal和CPRG来评估酶活性。这两种菌株表现出不同的酶-底物亲和力，导致颜色变化速率不同，从而实现了视觉区分。这项工作首次提出了单酶双底物比色检测方法，能够同时检测和区分大肠杆菌（E. coli）和O157:H7型大肠杆菌（E. coli O157:H7），并提供视觉和基于吸光度的结果。相比之下，之前的研究采用了双酶双底物方法。该检测方法在商用和基于纸张的96孔平台上显示出相同的检测限、区分性能和检测时间。纸张格式所需的试剂量更少，产生的废物更少，并允许预先固定试剂，只需添加样本即可在20分钟内完成颜色识别。通过机器学习模型对吸光度特征进行了定量分析，从而实现了超越视觉解读的准确细菌分类。该检测方法还使用添加了人工污染的食品样本进行了验证，证明了其作为经济实惠、智能且可在现场使用的食品安全监测和公共卫生保护工具的潜力。

材料与试剂

包括大肠杆菌（E. coli）（ATCC 11229）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 11632）、O157:H7型大肠杆菌（E. coli O157:H7）（ATCC 43888）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（MTCC 441）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）（MTCC 426）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（MTCC 441）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）（ATCC 13883）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（MTCC 2582）和肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）（ATCC 13076）在内的细菌菌株均来自印度的Himedia实验室。醋酸锂（C2H3LiO2）和氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷（CPRG）购自Sigma-Aldrich。

基于单底物检测大肠杆菌（E. coli）和O157:H7型大肠杆菌（E. coli O157:H7）

大肠杆菌（E. coli）和O157:H7型大肠杆菌（E. coli O157:H7）的β-半乳糖苷酶活性是一个公认的特性，之前已有研究使用X-gal和CPRG等显色底物进行检测（Kikuchi et al., 2020; Hong et al., 2022）。然而，仅有一项研究尝试基于酶活性区分这两种菌株，其检测策略与本研究所采用的方法不同（Kim et al., 2019）。β-半乳糖苷酶催化

结论

开发的基于纸张的双重检测比色方法代表了快速、经济和可持续检测大肠杆菌（E. coli）和O157:H7型大肠杆菌（E. coli O157:H7）的重大进展。该方法结合了单底物和双底物策略，其中双底物方法提供了更好的区分能力和实际应用性。表S8强调了该方法与现有方法相比的新颖性和用户友好性。

CRediT作者贡献声明

Hemant Sankar Dutta：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、资源管理、方法学、概念设计。 Jyoti Lakshmi Hati Boruah：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、资源管理、项目管理、方法学、研究、概念设计。 Archana Yadav：资源管理、方法学、研究。 Madhurima Borah：撰写 – 初稿撰写、验证、方法学、研究、数据分析、概念设计

未引用的参考文献

CDC, 2024; Chen et al., 2024; Chen et al., 2023; Disease information, 2012; coli, ; Broth, ; Escherichia coli, ; HiMedia Laboratories Pvt. Ltd,; Mueller et al., 2025; Olajide et al., 2024; Petrucci et al., 2022; Program, 2026; Rivas et al., 2015; Shiga toxin, 2012; Sigma-Aldrich,; South Kolkata complex battles E coli outbreak, 2025; Sun et al., 2022; UniProta, ; UniProtb, ; Wang et al., 2024; Xiao et al., 2023; Xu et al., 2024; Zhang et al., 2023.

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

所有作者感谢CSIR-NEIST主任（手稿编号CSIR-NEIST/PUB/2025/227）。MB感谢CSIR提供的SRF奖学金（授权编号181-1949-8252/2k24/1）。JLHB和HSD感谢印度古瓦哈提的Assam Agricultural University研究处通过DBT资助的ALSBT Hub（授权编号99/DRV/341/2023-24/Microgrants/7971-78）提供的资金支持。JLHB和HSD还感谢CSIR内部项目（OLP-2503A & OLP-2505C）提供的财务支持。