《Forensic Science International: Genetics》：Investigating the detection of two-person DNA mixtures using tri-allelic InDels
编辑推荐：
三等位InDel标记在分析两人DNA混合物中表现出更高似然比（LR），可检测1:29比例的次要贡献者，并适用于不平衡或降解样本。
李志民|陈银诺|季琦琦|窦润婷|王志民|邵成晨|徐红梅|谢建辉
复旦大学基础医学科学院法医学系，上海200032，中国
摘要
分析复杂的DNA混合物（如不平衡或降解的混合物）在当前的法医学实践中仍然是一个挑战。InDel标记产生较短的扩增子，并且基于小片段插入或删除的PCR扩增不会受到复制滑移的影响。在本研究中，评估了三等位基因InDels在分析两人混合物中的性能。共鉴定出38个等位基因间长度差异≥2 bp的三等位基因InDels，并开发了一种多重扩增检测方法（FA-HID39plex），该方法还包含性别鉴定标记（amelogenin）。与双等位基因InDels相比，这些三等位基因InDels在判断目标个体（POI）是否包含在两人DNA混合物中时能够生成更高的似然比（LR）。FA-HID39plex检测方法能够在1:29的比例下检测到次要贡献者。尽管在降解的混合物中由于等位基因丢失导致灵敏度降低，但仍然可以通过LR方法获得对POI存在的适度支持。总体而言，通过计算和评估LR，三等位基因InDels可以作为有前景的辅助标记，用于分析不平衡或降解的两人DNA混合物中的POI。
引言
混合生物样本是法医案件中常见的证据类型，由两个或多个个体的体液或组织组成[1]，[2]。近年来，在法医实践中越来越多地遇到混合生物样本[3]，并且绝大多数样本来自两个个体[4]，[5]。与单源样本相比，DNA混合物的解释要复杂得多[6]，[7]，[8]，这常常使法医调查变得复杂。目前分析混合生物样本的方法主要依赖于短串联重复序列（STR）分析，随后进行统计评估，例如计算似然比（LR），以确定目标个体（POI）的DNA是否存在于混合物中[2]，[6]。在贡献者未知的情况下，可以应用概率基因分型来重建最可能的贡献者DNA谱型。为了提高混合物解释的准确性，研究人员开发了一系列计算算法和软件工具[9]，[10]，[11]，[12]，如EuroForMix（EFM）、SMART和STRmix?。在相对平衡的混合物中，STR谱型有助于概率性地分配贡献者的基因型[12]，[13]。然而，在贡献者严重不平衡或生物样本降解的情况下，其性能会下降[3]，主要是由于等位基因丢失和断续扩增现象。
近年来，已经开发出新的方法来应对复杂DNA混合物分析中的这些挑战。例如，微单倍型标记被用于表征不平衡混合物并确定贡献者的数量（NOC）[14]，[15]。三等位基因SNP被应用于降解样本并取得了有希望的结果[16]，[17]，[18]，[19]。鉴于PCR-毛细管电泳（PCR-CE）在当前法医实践中的广泛应用，本研究旨在开发一种新型遗传标记，以实现快速检测和分析不平衡或降解的两人DNA混合物。
InDel标记通常是双等位基因的，表现出较低的多态性水平。然而，在我们之前的研究中报道了一组三等位基因InDels[20]，[21]。第三个等位基因被认为是由已建立的InDel位点的二次插入或删除事件产生的[20]，[22]，[23]。三等位基因InDels保留了传统双等位基因InDels的所有固有特征，同时增加了多样性[24]。它们能够识别混合生物样本，结合无断续扩增和短扩增子的特点，有助于检测不平衡两人混合物中的次要贡献者[25]，[26]，[27]，并提高了降解混合物的分析性能。这些特性使它们在分析不平衡或降解的两人DNA混合物时比STR标记具有明显优势。此外，在之前的研究中，InDel标记在检测DNA混合物方面的表现优于预期[28]。
在人类基因组中，大多数三等位基因InDels要么第三个等位基因的频率较低，要么等位基因间长度差异为1 bp[20]，[29]，这两点都限制了它们在法医实践中的实用性。在本研究中，鉴定了22个新的三等位基因InDels。结合之前报道的16个三等位基因InDels[21]，[30]和amelogenin（AMEL），开发了一种名为FA-HID39plex的多重检测方法来研究两人DNA混合物的检测。此外，还评估了POI的LR范围和概率基因型解卷积的准确性。
样本收集和DNA提取
在充分说明研究目的并获得知情同意后，收集了184名中国汉族个体的血液样本，其中包括94名男性和90名女性。本研究遵循伦理指南进行，并获得了复旦大学基础医学科学院伦理委员会的批准。为了评估物种特异性，分析中还包括了来自牛、猪、鸡、鸭、猫、狗和鱼（Lateolabrix maculatus）的血液样本。基因组DNA被
标记选择和多重系统开发
共鉴定了38个三等位基因InDels，其中22个是新发现的，16个来自之前的报道（表S1）[21]，[30]。所有这些位点都经过实验验证，确实含有三个不同的等位基因，等位基因间长度差异≥2 bp，适合进行毛细管电泳分析。选定的三等位基因InDels根据DNA片段的命名规则进行命名[38]：开头的“D”代表DNA，后面跟着
讨论
目前，在法医遗传学中常用的InDel位点是双等位基因的，尚未建立一套适用于法医应用的核心InDel标记。与双等位基因InDels相比，三等位基因InDels表现出更高的多态性，有助于识别DNA混合物。在本研究中，鉴定了38个覆盖所有常染色体的三等位基因InDels。所有选定的三等位基因InDels的等位基因间长度差异≥2 bp，这最大限度地减少了来自分离峰的干扰
结论
在本研究中，开发了一种多重扩增检测方法（FA-HID39plex），使用38个等位基因间长度差异≥2 bp的三等位基因InDels来分析两人混合物。群体遗传学分析表明，该检测方法具有较高的个体识别能力。与双等位基因InDels相比，在模拟的两人混合物中，使用三等位基因InDels可以获得更高的平均LR。在毛细管电泳分析中，
CRediT作者贡献声明
季琦琦：方法学，数据整理。陈银诺：方法学，数据整理。王志民：研究，数据整理。窦润婷：软件，数据整理。徐红梅：研究。邵成晨：软件，数据整理。谢建辉：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理，概念构思。李志民：撰写——初稿，可视化，软件，方法学，正式分析，数据整理。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2024YFC3306703）的支持。
