利用分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer, MIP)技术基于电化学传感器检测白色念珠菌(Candida albicans, C. albicans)

《Polymers》：C. albicans Detection with Electrochemical Sensors by Using Molecular Imprinted Polymer Technique Naphatsawan Vongmanee, Jindapa Nampeng, Chuchart Pintavirooj and Sarinporn Visitsattapongse

　　

摘要：白色念珠菌(Candida albicans, C. albicans)是一种机会致病性真菌，是院内感染的主要病原体，尤其在免疫功能低下患者中。传统的血培养和生化检测方法虽准确，但需多步样品处理且耗时较长，限制了其在快速临床筛查中的应用。本研究研究人员开发了一种基于分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer, MIP)技术的电化学生物传感器，用于快速、选择性地检测完整的C. albicans菌体。MIP层通过电聚合沉积于丝网印刷碳电极(Screen-Printed Carbon Electrode, SPCE)表面，形成与真菌形态互补的特异性识别空穴。采用循环伏安法(Cyclic Voltammetry, CV)于磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline, PBS)中进行电化学表征与检测。该系统表现出较宽的线性检测范围，可对1至104CFU/mL浓度区间内的C. albicans进行可靠定量，并获得1.30 CFU/mL的超低检出限(Limit of Detection, LOD)，显示出高灵敏度。通过对大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)的选择性验证，证实印迹空穴能有效区分真菌细胞与细菌污染物。上述结果表明，基于MIP的电化学生物传感器作为一种简便、低成本、便携式的早期真菌诊断替代方案具有良好应用前景。

利用分子印迹聚合物(MIP)技术基于电化学传感器检测白色念珠菌(C. albicans)的研究解读

白色念珠菌(Candida albicans, C. albicans)是人体正常菌群的一部分，但在免疫受损或微生态失衡时可引发从黏膜感染到侵袭性念珠菌血症的严重疾病，其院内感染死亡率较高。目前临床常规依赖血培养、镜检及生化鉴定，分子生物学方法如PCR虽有高灵敏度但仪器昂贵、操作复杂、周转时间长，无法满足床旁快速筛查需求。因此，开发低成本、快速、高选择性且无需生物探针（如抗体/核酸）的检测平台具有重要临床意义。本文研究人员提出利用分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer, MIP，即一种在模板分子/细胞存在下聚合、去除模板后留下特异性识别空穴的合成仿生识别材料)技术，在丝网印刷电极表面构建匹配C. albicans完整细胞形态的识别位点，结合循环伏安法(Cyclic Voltammetry, CV)实现定量检测。该研究发表于《Polymers》。

研究人员主要开展的关键技术方法如下：以固定灭活的完整C. albicans细胞为模板分子，甲基丙烯酸甲酯(Methyl Methacrylate, MMA)与丙烯酰胺(Acrylamide, AAM)为功能单体，N,N′-(1,2-二羟乙基)双丙烯酰胺(DHEBA)为交联剂，偶氮二异丁腈(Azobisisobutyronitrile, AIBN)为引发剂，掺入氧化石墨烯(Graphene Oxide, GO)提高导电性，在金工作电极表面的丝网印刷电极(Screen-Printed Electrode, SPE)上混合预聚物与模板后经紫外(UVA)引发聚合及热自组装，再经稀乙酸洗脱去除模板形成MIP传感层；以非印迹聚合物(Non-Imprinted Polymer, NIP，即不含模板同期制备的对照聚合物)为对照；采用CV检测铁氰化钾/亚铁氰化钾 redox probe在[PBS含不同浓度C. albicans]中的峰值电流变化来定量，通过原子力显微镜(Atomic Force Microscopy, AFM)观察印迹空穴形貌，并以三种常见细菌为干扰物评估选择性，制备多支平行电极评估重现性。

3.1. C. albicans Imprint on Gold SPE（金SPE上C. albicans印迹效果验证）

研究人员通过AFM观察聚合后嵌入菌体的MIP膜及洗脱模板后的表面形貌，发现洗脱后存在直径约5.5 μm的清晰空穴，与C. albicans典型尺寸吻合，证实模板成功嵌入并被有效移除，形成了可特异性匹配真菌形态的识别位点。

3.2. Cyclic Voltammetry of C. albicans Detection（C. albicans检测的循环伏安响应）

研究人员对不同浓度(1–10⁴CFU/mL)C. albicans进行CV检测，空白溶液电流最高，随真菌浓度升高峰电流逐渐下降，源于菌体结合于印迹空穴阻碍电子传递。五种单体配比中MMA:AAM=3:2(条件4)灵敏度最高，校准曲线斜率9.4968，R²=0.9718，证明该配比聚合物兼具刚性骨架与合适官能团，利于形成高保真印迹位点和灵敏信号转换。

3.3. Selectivity Test of C. albicans Detection（C. albicans检测的选择性测试）

研究人员将传感器分别暴露于E. coli、P. aeruginosa及S. aureus各浓度梯度的菌液中，三者引起电流抑制百分比(log浓度下斜率分别为7.44%、7.23%、4.98%·log^?1(CFU/mL))显著低于C. albicans(10.50%·log^?1(CFU/mL))，表明尺寸/形态不匹配的细菌难以进入印迹空穴，MIP传感器对C. albicans具高选择性。

3.4. Comparison of NIP and MIP Sensor（NIP与MIP传感器的对比）

研究人员在相同条件下制备NIP修饰电极进行对比，MIP传感器校准曲线斜率(8.9781)远高于NIP(2.3243)，且MIP对C. albicans响应更强。NIP因无特异性空穴仅靠非特异性吸附致信号弱，证实印迹过程成功构建了选择性结合位点，是提升检测性能的关键。

3.5. Reproducibility of the Sensor（传感器重现性）

研究人员独立制备三支MIP修饰电极(n=3)检测同浓度C. albicans，相对标准偏差(Relative Standard Deviation, RSD)为3.47%~8.83%，表明制备流程稳定、传感层均一性好，具备良好批次间重现性。

3.6. Comparison with Previously Reported Methods for C. albicans Detection（与已有C. albicans检测方法的比较）

研究人员将该MIP传感器性能指标与已报道电化学免疫传感器、qPCR等方法对比，本工作LOD=1.30 CFU/mL、线性范围1–10⁴CFU/mL，优于多数已报道MIP电化学传感器(LOD 2.8 CFU/mL，范围10⁴–10⁷CFU/mL)及EIS免疫传感器(LOD 10 CFU/mL)，且与qPCR灵敏度相当但无需复杂设备。

讨论与结论部分总结：

研究人员经五种单体比例筛选确定MMA:AAM=3:2最优，PMMA提供机械强度与羧基/羟基官能团利于完整细胞印迹；AFM确认空穴形貌匹配；CV信号递减规律反映目标结合阻塞电子传递；对三种细菌交叉响应低验证特异性源于形态尺寸匹配而非单纯表面吸附。整体表明条件4配方在稳定性、印迹保真度、灵敏度与选择性间取得最佳平衡。

结论：本研究展示了采用MIP技术电聚合于SPE上检测C. albicans的可行策略。MMA:AAM=3:2聚合体系对C. albicans显示最高分析性能，对数浓度下电流变化率达10.50%，线性相关系数R²=0.9718(文中结论段亦给出R²=0.9918之汇总值)，LOD达1.30 CFU/mL，线性范围1–10⁴CFU/mL，且对常见细菌干扰物选择性良好。尽管目前仅在PBS中验证，该MIP电化学生物传感器在简易、快速、低成本早期真菌诊断中具临床应用潜力。