多糖定量自动化：基于液体处理技术实现的高通量快速检测

《BioTech》：Automation of Polysaccharide Quantification: A Rapid High-Throughput Assay Enabled by Liquid Handling Technology Samuel Nicacio, Winston Umakanth Balasundaram, Aboli Bhingarkar, Daniel Cho, Rashmi Ghayal, Anup Datta and Subhash V. Kapre

　　

目前用于多糖定量的方法包括高效液相色谱(HPLC)和各种比色法。其中，蒽酮-硫酸法(anthrone assay)在样品基质适用的情况下（如糖结合疫苗的单糖中间体）被广泛采用。尽管该方法相对安全、快速且经济，但其需要大量人工操作时间，不适合高通量处理。此外，由于蒽酮-硫酸试剂具有腐蚀性，给自动化带来了独特挑战。本文报道了一种通过液体处理系统(LHS)实现的自动化蒽酮法。研究人员使用传统蒽酮法和后续的LHS蒽酮法对23种肺炎球菌(PNU)多糖血清型进行了定量。LHS蒽酮法经评估其准确度并与手动方法进行比较，随后依据ICH Q2 (R2)指南进行了验证。据研究人员所知，这是首个完全无人值守且具备防腐功能的蒽酮法，并已通过ICH Q2 (R2)验证，能够实现过夜批量运行。所开发的检测方法定量多糖的准确度为81–115%，精密度（变异系数）小于7.0%，线性范围为30至650 μg/mL (R2≥ 0.993)。该方法每小时可处理8个样品，支持过夜运行，并能自动完成所有移液、孵育和数据导出步骤。

该论文题为《Automation of Polysaccharide Quantification: A Rapid High-Throughput Assay Enabled by Liquid Handling Technology》，由Samuel Nicacio、Winston Umakanth Balasundaram、Aboli Bhingarkar、Daniel Cho、Rashmi Ghayal、Anup Datta及Subhash V. Kapre共同撰写，发表于《BioTech》期刊。论文针对糖结合疫苗研发与生产中的多糖定量难题，开发并验证了一种基于液体处理系统（Liquid Handling System, LHS）的自动化蒽酮-硫酸法（anthrone-sulfuric acid assay）。

在糖结合疫苗的开发与表征中，多糖定量是关键的质控环节。传统的蒽酮法虽然成本低廉且操作相对安全，但存在显著局限性：一是依赖大量人工操作，难以满足高通量需求；二是蒽酮-硫酸试剂具有强腐蚀性，对自动化设备的材质构成挑战；三是反应通常在热水浴中进行，过程繁琐且耗时。尽管已有研究尝试将反应移至微孔板以简化流程，但仍未能解决人工处理腐蚀性试剂的风险及通量瓶颈。因此，研究人员旨在设计一种全自动、高通量且能规避腐蚀风险的蒽酮法定量方法，以适应疫苗生产中大规模样本的检测需求。

为实现这一目标，研究人员采用了几项关键技术方法：首先，利用Hamilton STAR液体处理系统进行全流程自动化控制，涵盖移液、孵育及数据导出；其次，设计了定制化的危险试剂容器（hazardous reagent container）以安全存储和分配蒽酮-硫酸试剂，防止设备腐蚀；再次，优化了反应体系，直接在96孔板中进行高温孵育；最后，选取了23种肺炎球菌（Pneumococcal, PNU）多糖血清型（包括2、4、5、6B等）作为样本，并依据国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q2 (R2)指南进行了全面的方法学验证，包括特异性、精密度、线性和准确度评估。

研究结果分为三个主要部分：

在可比性测试（Comparability Testing）中，研究人员对23种PNU血清型多糖分别采用手动蒽酮法和LHS法进行测试。结果显示，所有血清型的LHS结果与手动结果的比值均在±20%的可接受范围内，表明两种方法具有高度可比性。Bland-Altman分析进一步证实，除PNU 2外，其余所有血清型的结果差异均落在平均值的±2个标准差之内。

在边缘效应（Edge Effects）研究中，鉴于反应直接在96孔板加热器上进行，研究人员评估了孔板边缘与内部的孵育均匀性。数据分析发现，虽然边缘孔与内部孔之间存在微小但统计学显著的吸光度差异（<2%），但考虑到实际分析影响及长期高温暴露可能导致的板变形，最终验证决定仅使用板内部的60个孔位进行实验，以确保数据的稳定性与可靠性。

在LHS方法验证（Anthrone LHS Validation）方面，选取7种代表性血清型（2、4、5、6B、8、9V、12F）进行了全面评估。结果显示，该方法的批内和批间精密度（变异系数）均小于7.0%；在30至650 μg/mL范围内表现出优异的线性（R²≥ 0.993）；准确度范围为81%–115%，各项指标均符合ICH Q2 (R2)指南的严格要求。

讨论部分指出，该研究成功建立了与手动法相当且通过ICH验证的自动化蒽酮LHS检测方法。通过稀释样本策略有效解决了不同血清型因粘度差异导致的移液误差问题，避免了繁琐的液体类别（liquid class）定制。特别值得强调的是，定制的危险试剂容器有效解决了硫酸试剂对设备的腐蚀问题，使得Hamilton STAR系统在三年维护期内未发现腐蚀损伤。虽然当前验证的循环时间约为80分钟，但研究人员探讨了进一步优化空间，如调整样品与试剂比例至1:5并将孵育时间缩短至20分钟，有望将周期缩短至一小时左右，进一步提升效率。此外，该系统具备过夜连续运行能力，每小时可处理8个样品，并能自动将数据导出至实验室信息管理系统（LIMS），极大减少了人工干预。

结论部分总结道，本研究克服了传统蒽酮法因人工操作和试剂腐蚀性带来的障碍，报道了一种完全验证的自动化检测方案。该方案实现了每小时8个样品的通量，具备过夜运行能力，准确度达81–115%，精密度（CV）<7.0%，线性范围为30–650 μg/mL (R²≥ 0.993)。这一成果显著提升了糖结合疫苗生产中多糖定量的通量，已准备好应用于GMP/CMC监管环境下的QC实验室。