比较疏水相互作用色谱法中等温线参数的测定方法

《Journal of Chromatography A》：Comparing isotherm parameter determination methods for hydrophobic interaction chromatography

本文比较了 Parente and Wetlaufer、Yamamoto 和逆方法用于氢键色谱（HIC）等温线参数的确定。通过线性梯度洗脱实验和交叉验证，发现逆方法参数最准确，但依赖高质量色谱图；Yamamoto方法鲁棒性相似且计算高效，适用于低负载条件。研究结果为HIC机制建模提供实用指导。

　　

蒂姆·奈因亨胡伊斯（Tim Neijenhuis）| 托马斯·卡迪亚·埃·瓦莱（Tomás Cardia e Vale）| 奥利维尔·勒布西（Olivier Le Bussy）| 杰弗罗伊·格尔德霍夫（Geoffroy Geldhof）| 玛丽克·E·克莱因（Marieke E. Klijn）| 马塞尔·奥滕斯（Marcel Ottens）

荷兰代尔夫特理工大学生物技术系

摘要

疏水相互作用色谱（HIC）是生物制药下游加工中广泛使用的分离方法。在工艺开发过程中，可以通过建立力学模型来模拟色谱过程中的蛋白质传输和吸附现象，从而缩短开发时间。模型中参数的准确性对于成功应用该方法至关重要。本研究比较了三种用于简化线性HIC等温线的参数测定方法：Parente和Wetlaufer方法、Yamamoto方法以及逆向方法。这些方法通过相同的线性梯度洗脱（LGE）实验对两种蛋白质进行了测试，并利用三次LGE实验结果进行了交叉验证以确定参数的准确性。最终，这些参数在具有不同初始和最终盐浓度的替代线性梯度条件下也进行了验证。虽然所有方法的结果都相当，但逆向方法得到的参数准确性最高。该方法需要高质量的色谱图，而其他方法只需要保留体积数据，因此在信号质量较差时适用性较低。Yamamoto方法与逆向方法具有相似的稳健性，且表现优于Parente和Wetlaufer方法。因此，Yamamoto方法是参数测定的一个良好选择。这项比较为等温线测定方法的选择提供了实际指导，从而有助于实现对HIC过程的可靠力学建模。

引言

疏水相互作用色谱（HIC）是生物制药下游加工多个阶段中广泛应用的分离方法[1,2]。它作为一种正交方法，与离子交换色谱（IEX）相对，因为HIC是基于表面的疏水性而非表面电荷进行分离的[2]。蛋白质的亲和力受溶剂排斥效应的影响，这种效应可以通过抗变性离子增强或被变性离子减弱。为了建立稳定的分离过程，需要优化这些效应。因此，工艺开发涉及对操作条件的详细筛选。

为了加速色谱纯化步骤的设计，可以结合使用计算机模拟工具和高通量实验[3],[4],[5]。最近，力学模型（MMs）被证明能够提高对工艺的理解[6],[7],[8],[9],[10],[11],[12],[13]。这些模型能够描述蛋白质在色谱柱中的流动和传质过程。蛋白质的动态吸附过程通过吸附等温线来表征，该等温线描述了固体相和液体相中蛋白质浓度的平衡[14]。对于HIC，通常使用Mollerup[15],[16],[17]开发的等温线来模拟在不同盐浓度下的蛋白质吸附[18],[19],[20]。该等温线基于化学计量置换模型，并利用活度系数来考虑盐的影响[17]。应用这一等温线需要确定多个参数，这些参数可以通过一系列线性梯度洗脱（LGE）实验或批量吸附实验获得。这些参数的准确性对于确保蛋白质吸附模型的准确性至关重要。

逆向方法（IM）是一种常用的等温线参数估计方法，已被证明能够为不同的色谱模式提供准确的模拟[12],[21],[22],[23],[24],[25]。逆向方法将力学模型的结果与实验色谱图进行拟合，并更新等温线参数以最小化模型与实验之间的差异。因此，需要高质量的纯组分色谱图来进行准确的参数估计。另一种方法是根据蛋白质的保留体积来估计等温线参数。Parente和Wetlaufer（PW）方法（非线性）以及Yamamoto方法（线性）是通过相关性将LGE条件与保留体积联系起来的方法[26,27]。尽管这两种方法最初是为IEX开发的，但最近也有文献将其应用于HIC[20,28]。由于不需要迭代模拟，这种方法在处理大型数据集时计算效率更高[29]。然而，这些相关性只能确定等温线的线性部分，因此仅适用于低负荷条件。

在本研究中，我们使用相同的LGE实验比较了逆向方法（IM）、Parente和Wetlaufer方法（PW）以及Yamamoto方法得到的等温线的准确性。为此，我们应用了传输分散模型和Mollerup开发的等温线线性部分来模拟两种蛋白质在稀释条件下的吸附行为。随后通过交叉验证验证了模型参数，并将其与实验色谱图进行了比较。定量分析基于峰最大值和峰宽度的差异进行。最后，在不同的盐梯度条件下测试了估计的等温线参数的稳健性。因此，这项工作有助于选择合适的方法，从而提高HIC过程力学建模的可靠性。

材料与设备

保留实验是在?kta pure系统（Cytiva，美国马尔堡）上进行的，该系统配备了预装的HiTrap Butyl FF 1 mL色谱柱（Cytiva，美国马尔堡）（附录A1）。所有试剂均购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯），缓冲液使用Milli-Q Advantage A10超纯水过滤器（Merck Millipore，美国伯灵顿）制备。缓冲液溶液由50 mM磷酸钠和不同浓度的硫酸铵（2.0 M、1.5 M）配制而成。

线性梯度洗脱实验

所有三种HIC参数估计方法都需要进行LGE实验。测定了胰凝乳蛋白酶原和葡糖淀粉酶在5种不同梯度长度下的色谱保留行为（图1）。对于这两种蛋白质，观察到它们的保留行为都向梯度的起始部分偏移。在胰凝乳蛋白酶原的色谱图中，梯度长度为15至40 CV时，在主峰之前出现了一个肩峰。这被认为是构象变化的结果，因为高盐浓度

结论

在这项研究中，我们比较了Parente和Wetlaufer方法、Yamamoto方法以及逆向方法，以获得简化版Mollerup等温线的参数。这些方法分别使用了五种不同的LGE实验（梯度长度分别为10、15、20、30和40 CV）来测定胰凝乳蛋白酶原和葡糖淀粉酶的参数。虽然不同方法得到的参数数量级相近，但葡糖淀粉酶的早期洗脱结果出现了系统性的低估

CRediT作者声明

蒂姆·奈因亨胡伊斯（Tim Neijenhuis）：概念设计、方法论研究、数据验证、数据整理、初稿撰写、审稿与编辑、可视化。 托马斯·卡迪亚·埃·瓦莱（Tomás Cardia e Vale）：方法论研究、数据验证。 奥利维尔·勒布西（Olivier Le Bussy）：指导工作、审稿与编辑。 杰弗罗伊·格尔德霍夫（Geoffroy Geldhof）：指导工作、审稿与编辑。 玛丽克·克莱因（Marieke Klijn）：指导工作、审稿与编辑。 马塞尔·奥滕斯（Marcel Ottens）：资金筹集、概念设计、指导工作、审稿与编辑。

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蒂姆·奈因亨胡伊斯（Tim Neijenhuis）：审稿与编辑、初稿撰写、可视化、数据验证、方法论研究、数据整理、概念设计。 托马斯·卡迪亚·埃·瓦莱（Tomás Cardia e Vale）：数据验证、方法论研究。 奥利维尔·勒布西（Olivier Le Bussy）：审稿与编辑、指导工作。 杰弗罗伊·格尔德霍夫（Geoffroy Geldhof）：审稿与编辑、指导工作。 玛丽克·E·克莱因（Marieke E. Klijn）：审稿与编辑、指导工作。 马塞尔·奥滕斯（Marcel Ottens）：审稿与编辑、指导工作、资金筹集、概念设计。