一种用于选择性测定人血浆中硫化氢和结合型硫烷硫的简单高效液相色谱（HPLC）方法

《Journal of Chromatography B》：A simple HPLC method for selective determination of hydrogen sulfide and bound sulfane sulfur in human plasma

高灵敏度液相色谱法结合荧光检测用于生物材料中硫化氢离子（HS?）和结合硫的测定，线性范围0.5-10.0 μM，检测限10 nM，血浆中HS?平均0.51 μM，结合硫1.55 μM，证实血浆结合硫能力有限。

　　

Kaho Arai|Tasuku Kayama|Shin Koike|Yuki Ogasawara

明治制药大学分析生物化学系，日本东京Kiyose市Noshio 2-522-1，邮编204-8588

摘要

本文开发了一种基于高效液相色谱（HPLC）和荧光检测的简单灵敏方法，用于测定生物材料中的硫化氢离子（HS^?）和结合态（硫烷）硫。结合态硫是指能够被二硫苏糖醇（DTT）还原为HS^?的二价硫。HS^?和DTT可还原的硫化物通过与

-苯二胺

和FeCl₃反应转化为荧光衍生物硫堇。随后使用反相HPLC和荧光检测法测定硫堇的含量。HS^?和结合态硫的校准曲线在0.5至10.0 μM范围内呈线性，该方法能够检测到10 nM的结合态硫或HS^?（0.5 pmol）。将GSSSG加入人血清后，结合态硫的回收率分别为98.4 ± 11.5%（0.5 μM）和96.3 ± 5.3%（5.0 μM）。该方法应用于人血浆中HS^?和结合态硫的测定。健康受试者（n = 10）的血浆中HS^?平均浓度为0.51 ± 0.06 μM，结合态硫的平均浓度为1.55 ± 0.35 μM。此外，我们使用现有方法对血浆的硫化物结合能力进行了详细分析，结果表明血浆对HS^?的结合能力有限。总体而言，本研究方法有望用于测定HS^?和结合态硫在器官及细胞器中的分布和动态。

引言

20世纪70年代，Westley等人提出了还原态硫的存在，并将其称为“硫烷池”[1]。他们将仅与其他硫原子结合的-2价硫定义为“硫烷硫”，但这一术语特指能与氰离子反应生成硫氰酸根离子的硫物种。随后，Stipanuk等人提出体内产生的硫化氢离子（HS^?在保持还原状态的情况下被储存[2]。然而，作为氰化物解毒成分的硫烷硫的形式和含量在体内尚未明确。

因此，我们将硫烷硫重新定义为结合态硫[3]。结合态硫是指在还原过程中释放为HS^?的硫原子，包括多硫化物中的硫原子和过硫化物结构外的硫原子。也就是说，结合态硫可以通过测量可被二硫苏糖醇（DTT）还原为HS^?的硫原子总量来量化。

我们首次报道了一种利用HS^?在FeCl₃存在下与

-苯二胺

氧化缩合生成荧光染料硫堇的反应的测定方法[4]。这种硫化物衍生物染料通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离，并通过荧光检测进行特异性检测。随后，我们结合这种硫堇-HPLC方法和连续流式气体透析[3]开发了一种测定结合态硫的方法，该方法对生物样品预处理非常有效[5]。这种气体透析-HPLC方法是首个能够分离和定量游离HS^?、酸不稳定硫和结合态硫的系统。该方法比传统用于测定硫烷硫的氰化法[6]具有更高的灵敏度，也比用于测定HS^?的亚甲蓝-HPLC方法更灵敏、更具选择性。我们将该方法应用于生物样品中结合态硫的测定，发现健康人血清中的结合态硫浓度为1.0 μM[3]。此外，我们还测定了大鼠肝脏、肾脏、大脑、脾脏和心脏中的结合态硫含量[7]。然而，该方法需要专用的气体透析装置来去除多余的DTT、蛋白质和其他杂质。特别是，手工组装的透析装置限制了其作为分析平台的多功能性，可能阻碍了其广泛应用。

进入本世纪后，体内产生的HS^?迅速成为第三种重要的气体物质，相关研究持续至今[8]、[9]。在HS^?研究过程中，结合态（硫烷）硫的存在也逐渐得到认可，近年来迫切需要开发合适的实用分析方法。近年来，人们积极开发各种荧光探针来测定细胞内二硫化物和HS^?的浓度，以及分析这些硫物种的个别形式、细胞内定位和动态[10]、[11]。然而，研究表明，在生理条件下，多硫化物、过硫化物和HS^?等结合态硫物种处于平衡状态[12]。这意味着它们在细胞内容易相互转化并呈现多种形式，因此它们不太可能以单一特定形式在组织或细胞中长期存在。

鉴于目前已有多种分析方法报道，但结果差异较大，我们认为有必要回归基础，建立一种简单而准确的测定总硫和HS^?的方法。在本研究中，我们从零开始重新审视了硫堇-HPLC方法，并对其预处理步骤进行了简化并提高了灵敏度。我们的目标是开发一种多功能且高灵敏度的分析方法，能够分离和定量生物样品中的结合态硫和HS^?

方法部分

试剂

DTT和

-苯二胺二盐酸盐

购自东京化成株式会社（日本东京）。三氯化铁、五水合硫化钠（Na₂S·5H₂O）、硫堇醋酸盐和HPLC级甲酸购自富士胶片和和光株式会社（日本大阪）。谷胱甘肽三硫化物（GSSSG）购自Peptide Institute, Inc.（日本大阪）。乙腈（HPLC级）购自关东化学株式会社（日本东京）。其他所有试剂均为市售最高纯度产品。

储备溶液和试剂

10 μM HS^?

样品制备

图1展示了本方法的反应过程和检测原理。与以往方法的主要区别在于，本方法在含有过量DTT和蛋白质等杂质的反应溶液中进行测定，无需使用气体透析装置。

我们首先使用GSSSG（一种结合态硫）在不同DTT浓度下测定生成的硫堇量，以确定合适的DTT浓度。如图2A所示

讨论

传统上，“硫烷硫”[13]是通过经典的氰化反应[14]进行量化的。在氰化反应中，氰离子与硫烷硫反应生成硫氰酸根离子，后者再与铁离子形成复合物。硫烷硫的量通过比色法测定铁-硫氰酸根复合物的颜色来确定。然而，由于“硫烷硫”这一术语的认可度较低且其性质存在不确定性，我们重新定义了这一概念

结论

我们开发并验证了一种简单、特异性强、准确且可重复的高效液相色谱-荧光方法，用于选择性定量人血浆中的结合态（硫烷）硫和HS^?。该方法无需专用样品预处理设备即可成功应用于血浆中结合态硫和HS^?的定量。尽管该方法基于30多年前开发的传统方法，但它极其简单且成本低廉。

CRediT作者贡献声明

Kaho Arai：验证、方法学、实验设计、数据管理。Tasuku Kayama：方法学、实验设计。Shin Koike：撰写 – 审稿与编辑、数据管理、概念构思。Yuki Ogasawara：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资金申请、概念构思。

伦理声明

本研究涉及人类受试者，已获得明治制药大学伦理审查委员会（批准编号：202122）和东京都医学科学研究所（批准编号：23-12）的批准。所有健康受试者均由东京都医学科学研究所招募。所有程序均遵循《赫尔辛基宣言》进行。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS KAKENHI）（资助编号：22K06780和25K10098）的支持。作者感谢参与研究的健康受试者，同时也感谢东京都医学科学研究所的实验室技术人员的协助。